Приказ МЗ РФ №87 от 26 марта 2001 года "О совершенствовании серологической диагностике сифилиса"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

  

                                 ПРИКАЗ

  

                            26 марта 2001 г.

  

                                  N 87

  

        О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

  

       Эпидемиологическая ситуация    с   заболеваемостью   сифилисом

   остается крайне напряженной.  С начала  90-х  годов  она  возросла

   почти  в  40  раз  и в 1999 г.  достигла 186,7 случаев на 100 тыс.

   населения.

       Серьезность ситуации усугубляется  тем,  что  сифилис,  как  и

   другие   инфекции,   передаваемые   половым   путем,  способствует

   распространению ВИЧ - инфекции.

       Одним из основных мероприятий,  направленных на предупреждение

   дальнейшего распространения заболеваемости сифилисом, является его

   ранняя диагностика.

       Однако материально   -   техническая    база    серологических

   лабораторий     не     соответствует    потребностям    учреждений

   здравоохранения.  За  последние   десять   лет   число   кожно   -

   венерологических   диспансеров,   не   имеющих   в  своем  составе

   серологических лабораторий,  возросло с 25,3% в 1989 г. до 31,2% в

   1999 г.

       С целью совершенствования лабораторной  диагностики  сифилиса,

   повышения  качества  работы  и  обеспечения единства подхода по ее

   организации:

       ПРИКАЗЫВАЮ:

       1. Утвердить:

       1.1. Методические    указания    "Постановка    отборочных   и

   диагностических тестов на сифилис" (приложение N 1).

       1.2. Методические указания "Расчетные нормы времени проведения

   лабораторных исследований при диагностике сифилиса методом реакции

   пассивной гемагглютинации" (приложение N 2)

       2. Директору Центрального научно - исследовательского кожно  -

   венерологического   института   Минздрава   России  А.А.Кубановой,

   директору   Уральского   научно  -  исследовательского   института

   дермато  -  венерологии   и   иммунопатологии   Минздрава   России

   Н.В.Кунгурову,      директору      Нижегородского     научно     -

   исследовательского кожно - венерологического  института  Минздрава

   России Н.К.Никулину:

       2.1. Обеспечить организационно - методическое  руководство  по

   внедрению  диагностических тестов в субъектах Российской Федерации

   в соответствии с приложениями N 1 и N 2.

       2.2. До  01.06.2001  подготовить и представить в установленном

   порядке  необходимые  материалы  на  аккредитацию   серологических

   лабораторий  научно  -  исследовательских  институтов  в  качестве

   экспертных в здравоохранении.

       2.3. Обеспечить    проведение   внешнего   контроля   качества

   лабораторной диагностики сифилиса.

       3. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов

   Российской Федерации:

       3.1. Организовать   работу   по   серологической   диагностике

   сифилиса в соответствии с приложениями N 1, N 2.

       3.2. Принять   неотложные   меры   по  развитию  и  укреплению

   материально - технической базы серологических лабораторий, обратив

   особое внимание на организацию таких лабораторий в составе кожно -

   венерологических диспансеров.

       4. Считать  не  действующим на территории Российской Федерации

   приказ  Министерства  здравоохранения СССР  от 2 сентября 1985  г.

   N 1161 "О совершенствовании серологической диагностики сифилиса".

       5. Контроль за исполнением  настоящего  приказа  возложить  на

   Первого заместителя Министра А.И.Вялкова.

  

                                                              Министр

                                                         Ю.Л.ШЕВЧЕНКО

  

  

  

  

                                                       Приложение N 1

                                                  Утверждено приказом

                                                     Минздрава России

                                                от 26.03.2001 г. N 87

  

                         МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

  

                ПОСТАНОВКА ОТБОРОЧНЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ

                           ТЕСТОВ НА СИФИЛИС

  

                               Аннотация

  

       Методические указания    предназначены    для     лабораторных

   работников и  клиницистов  дерматовенерологической  службы России.

   Указания посвящены современным методам серо- и  ликвородиагностики

   сифилиса,  широко  апробированным  в  научно - исследовательских и

   лечебно - профилактических учреждениях страны.  Представлены новые

   высоко  чувствительные  специфичные методики постановки реакций на

   сифилис.  Освещено  предназначение  различных  тестов  в  качестве

   отборочных, диагностических и контрольных для оценки эффективности

   лечения.  Описаны  принципы  реакций,  методики   их   постановки,

   материально   -   техническое   обеспечение,  источники  получения

   ошибочных результатов и мероприятия по  технике  безопасности  при

   работе с инфекционным материалом.

       Организация - разработчик: ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.

       Авторы: докт. биол. наук, проф. Г.А.Дмитриев, докт. мед. наук,

   проф.  В.Н.Беднова,  докт. мед. наук Г.Ф.Тимченко, канд. мед. наук

   Г.А.Киселева,  канд.  мед.  наук  Т.И.Милонова,  канд.  мед.  наук

   О.А.Стоянова, З.П.Акопова.

  

                                Введение

  

       Для серо-  и ликвородиагностики  сифилиса   в   России   могут

   применяться следующие методы:

       1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР),

   которая  является  отборочным тестом при обследовании населения на

   сифилис.   Постановка   МР   осуществляется    с    плазмой    или

   инактивированной  сывороткой крови.  Зарубежные тесты ВДРЛ (VDRL),

   РПР (RPR) и другие  аналогичные  МР  как  по  принципу  постановки

   реакции, так и по чувствительности и специфичности.

       2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или

   патогенных бледных трепонем.

       3. Реакция  пассивной  гемагглютинации  (РПГА).   Антиген   из

   культуральных или патогенных бледных трепонем.

       4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях:

   РИФ-абс,  РИФ-ц,  РИФ  с  капиллярной кровью из пальца.  Антиген -

   патогенная бледная трепонема штамма Никольса.

       5. Комплекс серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий

   из реакции  связывания   комплемента   (РСК)   с   трепонемным   и

   кардиолипиновым антигенами,  и  МР.  Поскольку трепонемный антиген

   является специфическим,  КСР относится к диагностическим тестам. В

   связи  с  разработкой  более  чувствительных,  специфичных и менее

   трудоемких реакций стало возможным  заменить  при  постановке  КСР

   реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с

   МР.

       6. Реакция  иммобилизации бледных трепонем (РИТ),  в которой в

   качестве антигена используют патогенные бледные  трепонемы  штамма

   Никольса.

       РИТ, РИФ,  ИФА  и  РПГА   являются   высокочувствительными   и

   высокоспецифичными   реакциями   на   сифилис.   Они  относятся  к

   диагностическим  подтверждающим  тестам.  При  этом  в   связи   с

   простотой  постановки  и наличием коммерческих тест - систем ИФА и

   РПГА могут быть и высокоэффективными отборочными тестами.

       Ввиду различной  чувствительности  при разных формах сифилиса,

   специфичности и сложности постановки каждая из  указанных  реакций

   имеет свое предназначение.

       Профилактическое обследование  населения  на   сифилис   можно

   проводить  с  помощью  МР,  КСР,  ИФА и РПГА.  Все организационные

   вопросы  по  применению  данных  реакций  с  этой  целью  решаются

   органами  здравоохранения  на  местах  в  зависимости  от  местных

   условий и возможностей.

       При получении  положительного  результата  в МР пациент должен

   обследоваться дерматовенерологом с повторным исследованием крови в

   любом диагностическом тесте на сифилис.

       При профилактическом обследовании на сифилис больных  глазных,

   психоневрологических,  кардиологических стационаров, беременных, в

   частности,  направляемых на искусственное прерывание беременности,

   должны использоваться КСР, ИФА или РПГА.

       При обследовании доноров необходимо применять КСР или ИФА  или

   РПГА,  но  обязательно  в сочетании с МР.  Постановка двух реакций

   одновременно   обусловлена   высокой   ответственностью    данного

   исследования.

       МР в количественном  варианте  с  экономической  точки  зрения

   необходимо использовать в качестве контроля эффективности лечения,

   заменив  ею  количественную  постановку  РСК   с   кардиолипиновым

   антигеном.

       Вышеуказанные специфические тесты служат для диагностики  всех

   форм сифилиса,  в частности,  скрытого,  а также для распознавания

   ложноположительных  результатов,  полученных  в  МР  и  КСР.   При

   диагностике   скрытого   сифилиса  целесообразна  постановка  двух

   специфических тестов одновременно.

       Поскольку ИФА  и  РПГА  являются  более высокочувствительными,

   специфическими и воспроизводимыми тест - системами,  которые можно

   использовать   в  качестве  отборочных  и  подтверждающих  тестов,

   осуществить  до  2006  г. замену   комплекса   серореакций   (КСР)

   вышеуказанными реакциями при диагностике сифилиса.

       Таким образом,  последовательность обследования  пациентов  на

   сифилис представляется следующим образом:

       - при   первичном   обследовании    производится    постановка

   отборочной  (скрининговой)  реакции микропреципитации (РМП) или ее

   модификации  (RPR-  РПР,  TRUST  -   ТРАСТ,   VDRL   -   ВДРЛ)   в

   количественном  и качественном вариантах и в случае положительного

   результата - любого  специфического  подтверждающего  трепонемного

   теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);

       - после окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по

   снижению   титра   судят   о  динамике  инфекционного  процесса  и

   эффективности терапии.  Подтверждением  эффективности  проведенной

   терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года;

       - по окончании этого срока осуществляется  постановка  той  же

   специфической реакции,  что и при первичном обследовании.  Следует

   учитывать,  что специфические трепонемные тесты  могут  оставаться

   положительными  (не  негативировать)  в  течение  ряда  лет,  а  в

   отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.

       Методика постановки  и  суть  различных  модификаций МР,  ИФА,

   РПГА,  РИФ,  РСК и РИТ подробно описаны в  настоящих  Методических

   указаниях.

  

                             Формула метода

  

       Впервые детально  описаны 6 методов,  используемых для серо- и

   ликвородиагностики    сифилиса    включающих    15    модификаций.

   Рекомендована  замена  РСК  при  определении эффективности лечения

   сифилиса МР,  что дает экономический эффект.  Введена в инструкцию

   количественная  методика  постановки РИТ,  расширяющая возможности

   поздних форм сифилиса.  Включены  методики  постановки  РСК,  РИТ,

   РИФ-ц и ИФА для ликвородиагностики сифилиса.

  

                     Показания к применению метода

  

       Серо- и ликвородиагностика всех форм сифилиса.

  

       Противопоказаний нет.

  

         МИКРОРЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ С КАРДИОЛИПИНОВЫМ АНТИГЕНОМ

                           (ЭКСПРЕСС - МЕТОД)

  

       Принцип. При добавлении к плазме или сыворотке крови  больного

   сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат

   (комплекс антиген - антитело),  выпадающий в виде  хлопьев  белого

   цвета.

  

             Материально - техническое обеспечение метода

  

       Оборудование для взятия крови и постановки МР:

       - капиллярные пипетки аппарата Панченкова;

       - градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;

       - автоматические пипетки на 20-200 мкл;

       - наконечники для автоматических пипеток;

       - пробирки длиной 8-10 см и 14-15см,  диаметром 1-1,5  см  или

   центрифужные;

       - пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2

   см, глубиной не менее 0,5 см;

       - иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;

       - центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;

       - аппарат для встряхивания;

       - стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.

  

       Ингредиенты для МР:

                 - антиген кардиолипиновый для микрореакции;

                 - холин - хлорид (включается в упаковку с антигеном);

                 - натрий хлорид х.ч.;

                 - натрий лимоннокислый (цитрат натрия)трехзамещенный

                   Na C H O   5H O;

                     3 6 5 7    2

                 - мертиолат C H O S Na Hg.

                              9 9 2

       Растворы:

                 - изотонический раствор натрия хлорида 0,9%;

                 - 10%  раствор холин - хлорида  готовится  следующим

                 образом: к  29,65  мл изотонического раствора натрия

                 хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора  мертиолата

                 и 5 мл 70% раствора холин - хлорида. Смесь тщательно

                 перемешивают.   При   отсутствии   мертиолата    для

                 приготовления   10%   раствора   холин   -   хлорида

                 необходимо  к  30  мл   стерильного   изотонического

                 раствора  натрия хлорида добавить 5 мл 70%  раствора

                 холин - хлорида;

                 - 5%    раствор   трехзамещенного   цитрата   натрия

                 готовится на дистиллированной  воде  и  фильтруется.

                 Раствор  не стоек.  При помутнении его надо заменять

                 свежим.  Хранится  в  холодильнике  при  4  град.  в

                 течение 5-6 дней.

  

       Контрольные лиофилизированные  сыворотки  крови необходимы для

   установления  пригодности  эмульсии  антигена.   Отрицательную   и

   положительную     контрольные     сыворотки    крови    используют

   неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем

   ее  разведения  по  титру,  установленному  в  день  приготовления

   эмульсии  антигена.  При  отсутствии  лиофилизированных  сывороток

   крови  используют нативную положительную или смесь положительных в

   РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции  инактивированных

   сывороток  крови,  которые разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно

   закрывающимися   пробками,   хранят   в   морозильном    отделении

   холодильника,  используют  с  титром  выше 1:8.  В день постановки

   реакции сыворотку крови титруют на пластинке с целью подтверждения

   ранее  установленного  титра,  для  контроля  качества  эмульсии и

   получения слабоположительного результата, который используют затем

   в течение рабочего дня.

       Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в

   9  лунок  пластинки,  начиная  со  второй лунки,  вносят по 90 мкл

   изотонического раствора натрия хлорида  и  добавляют  в  первую  и

   вторую  лунки  по  90 мкл контрольной сыворотки крови.  Содержимое

   второй лунки перемешивают пипеткой,  насасывая и  выпуская  его  в

   лунку  5-6  раз.  Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки в

   пипетку и 90 мкл переносят  в  третью  лунку.  Содержимое  третьей

   лунки  перемешивают таким же образом и переносят в четвертую лунку

   и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл удаляют.

   Во  все  лунки  добавляют  по  30  мкл  эмульсии  кардиолипинового

   антигена.  Пластинку встряхивают в аппарате  в  течение  5  минут,

   добавляют  по  90  мкл  изотонического  раствора  натрия хлорида и

   оставляют  при  комнатной  температуре  на  5  минут,  после  чего

   регистрируют   результаты.   Разведение  сыворотки  крови,  давшее

   слабоположительный  результат  (+/  2+),  используют  в   качестве

   слабоположительного    контроля.    Для   получения   его   делают

   соответствующее  разведение.  Например,  если   слабоположительный

   результат  получен  с  разведением  сыворотки  крови  1:8,  то для

   получения  контрольной  слабоположительной   сыворотки   крови   в

   пробирку  вносят  0,7  мл изотонического раствора натрия хлорида и

   0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.

       При правильно  проведенном  титровании положительной сыворотки

   крови по мере ее  разведения  наблюдается  равномерное  уменьшение

   величины хлопьев преципитата.

       При снижении  реактивности  хранящейся  нативной   контрольной

   сыворотки  крови  используют разведение, дающее слабоположительный

   результат при повторном титровании.  Контрольную  сыворотку  крови

   можно  использовать  до  тех  пор,  пока  она  дает  положительный

   результат (4+) в разведении  не  ниже  1:2,  и  слабоположительный

   результат (2+) в разведении не меньше 1:4. При дальнейшем снижении

   реактивности употреблявшуюся положительную  контрольную  сыворотку

   крови заменяют новой.

       При хранении  контрольных  сывороток  крови   не   допускаются

   повторные  замораживания  их  и  оттаивание,  т.к.  в  этом случае

   реактивность их снижается.

       О снижении  реактивности  контрольной  сыворотки  крови,  а не

   эмульсии  антигена,  судят  по   параллельному   титрованию   этой

   сыворотки    крови    с   использованием   хранившейся   и   вновь

   приготовленной эмульсии.  Если получают один и тот же титр антител

   в  МР  с обеими антигенными эмульсиями,  то считают,  что снижение

   реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если

   же   снижение  реактивности  наблюдают  только  при  использовании

   хранившейся  эмульсии  антигена,  то  это  обусловлено   снижением

   реактивности   эмульсии   антигена,  которую  необходимо  заменить

   свежеприготовленной.

       Серологические лаборатории     кожно     -    венерологических

   диспансеров  должны  снабжать   контрольными   сыворотками   крови

   лаборатории района, использующие в своей работе экспресс - метод и

   не имеющие положительных  и  отрицательных  сывороток  крови.  При

   отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.

       Эмульсия кардиолипинового антигена готовится  из  специального

   кардиолипинового  антигена  для микрореакции преципитации.  Нельзя

   использовать    в    микрореакции     кардиолипиновый     антиген,

   предназначенный для реакции связывания комплемента.

       Перед приготовлением    эмульсии    обращают    внимание    на

   прозрачность  ампулированного  антигена.  При выпадении кристаллов

   холестерина их  растворяют  нагреванием  ампул  в  термостате  или

   водяной бане при 37 град. С или 56 град. С соответственно.

       Прежде чем  приготовить  эмульсию,  рассчитывают   необходимое

   количество   ее   на  рабочий  день  или  рабочую  неделю  (на  50

   исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку

   вносят  сухой  пипеткой  не  более  2 мл антигена,  добавляя его к

   равному  объему  0,9%  изотонического  раствора  натрия   хлорида,

   перемешивают,  оставляют  при  комнатной  температуре на 30 минут,

   затем центрифугируют  при  1000  об/мин  до  получения  прозрачной

   жидкости,  которую  удаляют,  а  к осадку добавляют 3,5 объема (по

   отношению к  взятому  антигену)  10%  раствора  холин  -  хлорида.

   Например,  если  требуемый  объем  антигена  равен 0,5 мл,  то для

   вычисления количества холин - хлорида 0,5 мл  умножают  на  3,5  и

   получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин - хлорида. Пробирку

   плотно закрывают пробкой и  содержимое  перемешивают,  опрокидывая

   пробирку, до полного ресуспендирования. Полученная эмульсия готова

   к   употреблению.   При   необходимости   приготовления   большого

   количества  эмульсии,  ее  готовят  не  в  одном  флаконе  большой

   емкости,  а в нескольких пробирках,  внося в каждую из них по 2 мл

   антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена,

   предохраняют  его  от  загрязнений  при   повторном   взятии   для

   постановки  реакции,  а  также  от нагревания и действия солнечных

   лучей.

       Эмульсию антигена  хранят в холодильнике при 4 град.  не более

   недели, а при добавлении раствора мертиолата - в течение 2 недель.

   В   день  постановки  реакции  нужное  для  данного  рабочего  дня

   количество  эмульсии  берут   из   холодильника,   оставляют   для

   согревания  при  комнатной  температуре на 30 минут и перемешивают

   ее, опрокидывая пробирку, закрытую пробкой, не менее 30 раз, затем

   проверяют   ее   пригодность   на  контрольных  сыворотках  крови.

   Применяемую  эмульсию  необходимо  защищать  от   света,   обернув

   пробирки  с  ней  черной  бумагой.  Пригодность каждой новой серии

   антигена проверяют в экспресс - методе одновременно с уже бывшей в

   работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках

   крови.  О  пригодности  антигена   судят   по   величине   титров,

   наблюдаемых  при  одновременном титровании положительных сывороток

   крови с новой и проверенной сериями антигенов.  Получение  близких

   результатов,  т.е.  величин титров реагентов, отличающихся на +/-1

   разведение,   одинаковой   выраженности    хлопьев    преципитата,

   наблюдаемых  в  одних и тех же разведениях положительных сывороток

   крови свидетельствует о пригодности  исследуемой  серии  антигена.

   Серию антигена бракуют,  если одновременное титрование контрольной

   положительной сыворотки крови с новой серией антигена  показывает:

   а)слабо  выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях

   сыворотки  крови;  б)  более  низкий  (на  2-3  разведения)   титр

   реагинов,  чем  с  употреблявшейся проверенной серией;  в) наличие

   преципитата в отрицательных сыворотках крови.

       Получение плазмы крови:

       Кровь берут из пальца так же,  как для  исследования  скорости

   оседания  эритроцитов  (СОЭ).  При взятии крови смачивают капилляр

   аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до

   метки  "25",  а  оставшийся  цитрат натрия выливают в центрифужную

   пробирку,  куда затем вносят три капилляра крови,  взятой до метки

   "К", перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в

   экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы  крови,

   которую   отсасывают   автоматической   пипеткой   для  проведения

   исследования.

  

       Получение инактивированной сыворотки крови:

       Кровь берут  из вены,  получают сыворотку крови и инактивируют

   ее так же, как для РСК.

  

       Методика постановки микрореакции:

       Качественную и   количественную   постановки   микрореакции  с

   испытуемой плазмой и  инактивированной  сывороткой  крови  следует

   осуществлять следующим образом.

       При использовании     качественной     методики     постановки

   микрореакции автоматической пипеткой забирают по 90 мкл плазмы или

   инактивированной сыворотки крови и  вносят  в  лунки,  куда  затем

   добавляют  по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена.  В каждую

   лунку вносят плазму или сыворотку крови от одного  обследуемого  и

   нумеруют соответственно    списку   в   регистрационном   журнале.

   Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины  во  встряхивателе

   (100  качаний в 1 минуту) в течение 5 минут,  затем в каждую лунку

   добавляют  по  90  мкл  изотонического  раствора  натрия  хлорида,

   перемешивают  покачиванием  пластины  и  оставляют  при  комнатной

   температуре на 5 минут (оптимальный  температурный  режим  реакции

   23-28 град.).  Результаты учитывают только после появления хлопьев

   в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

       При использовании     количественной    методики    постановки

   микрореакции в 9 лунок горизонтального ряда пластины,  начиная  со

   второй  лунки,  вносят  по  90  мкл изотонического раствора натрия

   хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл  исследуемой

   плазмы  или сыворотки крови.  Содержимое второй лунки перемешивают

   автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из нее в лунку 5-6

   раз,  затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей

   лунки 90 мкл переносят в четвертую и т.  д.  по десятую лунку,  из

   которой   90   мкл  удаляют.  Таким  образом  получают  двукратные

   разведения плазмы или сыворотки крови 1:2,  1:4,  1:8 и  далее  до

   1:516.  В  первую  лунку  изотонический  раствор натрия хлорида не

   приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки крови, т.е.

   исследуют  цельную  плазму  или  сыворотку  крови.  Во  все  лунки

   добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового  антигена.  Пластину

   встряхивают  5 минут,  после чего во все лунки добавляют по 90 мкл

   изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют

   результаты так же, как при постановке качественной реакции.

       Титром преципитинов считают последнее  разведение  плазмы  или

   сыворотки   крови,   где   обнаружен  преципитат.  Величина  титра

   указывает  на  активность  процесса,  а  его  снижение  во   время

   лечения  -  на   эффективность   терапии.   Стабильность    титров

   настораживает   клиницистов  в  отношении  эффективности  терапии,

   увеличение же их требует пересмотра лечения.

       Для получения  достоверных  результатов  следует  пользоваться

   одной  и  той  же  серией  препарата  при  обследовании больного в

   процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.

       К моменту  снятия  леченного  больного с учета неспецифические

   тесты с кардиолипиновым  антигеном  обычно  негативируются,  в  то

   время  как  позитивность  специфических  реакций может наблюдаться

   долго после окончания лечения,  в связи с чем эти тесты  не  могут

   служить  критерием  излеченности  и  больные  снимаются  с учета с

   положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.

  

       Источники ошибок при постановке МР:

       - неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха

   в капилляре пипеток);

       - исключение   из  постановки  реакции  контрольных  сывороток

   крови, в частности, слабоположительных;

       - неравномерная  концентрация  антигена  в эмульсии вследствие

   недостаточного перемешивания ее перед использованием;

       - бактериальное загрязнение эмульсии;

       - нарушение сроков  и  условий  хранения  плазмы  и  сыворотки

   крови, антигена и его эмульсии, растворов;

       - замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;

       - использование  при постановке реакций загрязненных пробирок,

   пипеток, пластинок, растворов.

       Вышеуказанные ошибки   могут   приводить   к   появлению   как

   ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.

  

         ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ СЕРО- И ЛИКВОРОДИАГНОСТИКИ

                                СИФИЛИСА

  

       Принцип иммуноферментного  анализа  заключается  в  соединении

   комплекса "антиген - антитело" с конъюгатом, содержащим ферментную

   метку, выявляемую с помощью субстратной смеси. В настоящее время в

   нашей стране ИФА тест - системы  разрабатываются  по  трем  схемам

   проведения реакции.

       В основе первой схемы лежит следующее:

       На твердофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета)

   зафиксирован антиген возбудителя сифилиса,  который инкубируется с

   испытуемой сывороткой,  плазмой крови или ликвором.  При наличии в

   этом материале от пациентов противотрепонемных антител  происходит

   их  связывание  в  комплекс "антиген - антитело" (I фаза реакции).

   После удаления не связавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с

   мечеными   ферментом  антителами  к  антивидовым  иммуноглобулинам

   (конъюгат),  в ходе которой  на  поверхности  носителя  происходит

   присоединение к имеющимся комплексам "антиген - антитело" антител,

   меченных ферментом  (II  фаза).  После  удаления  не  связавшегося

   конъюгата  в  ходе  инкубации  с  раствором  субстрата  (в  случае

   использования пероксидазного конъюгата,  это перекись  водорода  в

   сочетании  с  орто  -  фенилендиамином  (ОФД),  5-аминосалициловой

   кислотой (5-АСК)   или   тетраметилбензидином   (ТМБ))  происходит

   взаимодействие  фермента   с   субстратом,   в   результате   чего

   развивается  цветная  реакция,  интенсивность  которой  зависит от

   количества связанных сывороточных антител  (III  фаза).  Результат

   реакции   оценивается  спектрофотометрически  с  выводом  цифровых

   данных,  что исключает субъективность оценки,  или визуально,  что

   может быть полезным при отсутствии в лабораториях соответствующего

   оборудования.  По такому  принципу  в  настоящее  время  построено

   большинство ИФА тест - систем для диагностики сифилиса.

       Вторая схема  -  ИФА  с фиксированными антителами или "ловушка

   для  антител".  Здесь   на   твердофазном   носителе   фиксируются

   аффинноочищенные антитела     против     определенного      класса

   иммуноглобулинов  (М,  G  или А),  которые связывают находящиеся в

   испытуемых  сыворотках  крови   иммуноглобулины   соответствующего

   класса   (I  фаза  реакции).  Образование  комплекса  "антитело  -

   специфический  иммуноглобулин"  выявляют  с   помощью   конъюгата,

   состоящего из антигенов бледной трепонемы,  меченных ферментом (II

   фаза).  При инкубации с субстратом (III  фаза)  в  случае  наличия

   сифилитических  антител  в  испытуемой  сыворотке или плазме крови

   наступает окрашивание раствора.  В  нашей  стране  разрабатываются

   подобные    тест    -    системы,   в   основном   для   выявления

   противотрепонемных IgM.

       Третья схема ИФА используется для выявления суммарных антител,

   специфических для определенного антигена, независимо от их класса.

   Ее суть заключается в том, что специфические сывороточные антитела

   одновременно   взаимодействуют  с  антигеном,  зафиксированным  на

   твердофазном носителе,  и с тем же антигеном,  меченным ферментом,

   при  совместной  инкубации испытуемого образца и конъюгата (I фаза

   реакции).  Наличие образовавшегося комплекса определяют с  помощью

   субстрата (II фаза).

       В зависимости от используемых антигенов все ИФА тест - системы

   для выявления антител подразделяются на:

       1) лизатные  (лизированный   или   обработанный   ультразвуком

   возбудитель инфекции, полученный в культуре);

       2) рекомбинантные - используются полученные генно - инженерным

   способом   белки   -   аналоги   определенных  белковых  антигенов

   возбудителя;

       3) пептидные - использующие синтетические фрагменты белков.

       Среди отечественных  ИФА   тест   -   систем   для   выявления

   сифилитических    антител,   уже   рекомендованных   Министерством

   здравоохранения РФ к применению в  медицинской  практике,  имеются

   лизатные, рекомбинантные и пептидные.

       1. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  антител  к

   Treponema   pallidum   в   сыворотке  или  плазме  крови  человека

   "РекомбиБест антипаллидум" и "РекомбиБест антипаллидум  -  стрип".

   Разработчик  -  ЗАО  "Вектор  - Бест",  п.  Кольцово Новосибирской

   области. Назначение - выявление специфических IgG.

       2. Тест  -  система  иммуноферментная  для выявления антител к

   Treponema  pallidum  в  сыворотке  или   плазме   крови   человека

   "РекомбиБест антипаллидум - суммарные антитела". Разработчик - ЗАО

   "Вектор - Бест",  п.  Кольцово Новосибирской области. Назначение -

   выявление специфических IgM и IgG.

       3. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  антител  к

   возбудителю    сифилиса   "ИФА-АНТИ-LUIS".   Разработчик   -   НПО

   "Диагностические  системы",  г.  Нижний  Новгород.  Назначение   -

   выявление специфических IgG.

       4. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  антител  к

   возбудителю сифилиса (Treponema pallidum) на основе рекомбинантных

   белков.  Разработчик - БТК "Биосервис",  г.  Москва.  Назначение -

   выявление специфических IgG.

       5. Тест - система иммуноферментная для  выявления  IgM  и  IgG

   антител  человека  к  антигенам  Treponema pallidum ("ЛюисСкрин").

   Разработчик  -  ЗАО  "Ниармедик"  и  АЗОТ  "Диаклон",  г.  Москва.

   Назначение - выявление специфических IgM и IgG.

       6. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  антител  к

   возбудителю   сифилиса   ("ЭКОлаб   -   антипаллидум   -  скрин").

   Разработчик - ТОО "ЭКОлаб",  г.  Электрогорск Московской  области.

   Назначение - выявление специфических IgG.

       7. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  антител  к

   возбудителю  сифилиса ("ИФА-анти - трепонема").  Разработчик - ЗАО

   "Вектор  -  Майстар",  г.  Новосибирск.  Назначение  -   выявление

   специфических IgG.

       8. Тест - система иммуноферментная для качественного выявления

   антител   к   возбудителю  сифилиса  в  сыворотке  крови  человека

   ("АТ-Треп.-ИФТС").  Разработчик - ГП  "Аллерген",  г.  Ставрополь.

   Назначение - выявление специфических IgM и IgG.

       9. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  антител  к

   возбудителю  сифилиса  Treponema  pallidum  (Сиф  -  Ат - NN 1,2).

   Разработчик  -  ТОО  НИИ   "Аквапаст",   г.   Санкт  -  Петербург.

   Назначение - выявление специфических IgM и IgG.

       10. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  суммарных

   антител к возбудителю сифилиса ("ИФАанти-СИФ").  Разработчик - НПК

   "Препарат",   г.   Нижний   Новгород.   Назначение   -   выявление

   специфических IgM и IgG.

       Иммуноферментные тест  -  системы  для  диагностики   сифилиса

   выпускаются  в  виде  многокомпонентных  наборов,  содержащих  все

   реагенты,  необходимые для проведения реакции,  и инструкцию по их

   применению.

  

             Материально - техническое обеспечение метода:

  

       Лаборатории, в  которых осуществляется постановка ИФА,  должны

   быть укомплектованы:

       - набором  автоматических  пипеток  (микродозаторов),  который

   включает  в  себя  одноканальные   пипетки   переменного   объема,

   рассчитанные на дозирование 5-40,  40-200 и 200-1000 мкл жидкости,

   а также  8-канальные  пипетки  переменного  объема  на  5-50  (при

   использовании тест - систем с рабочим разведением образцов 1:100 и

   1:200) и 50-300 мкл;

       - набором мерной химической посуды;

       - термостатом,  рассчитанным  на  поддержание  температуры  37

   град. С;

       - дистиллятором лабораторным  для  получения  дистиллированной

   воды;

       - спектрофотометром планшетным;

       - холодильником;

       - рН-метром.

       Результаты ИФА с сывороткой крови и ликвором при использовании

   всех  тест  -  систем  с  автоматическим  учетом  регистрируют  на

   спектрофотометре для планшетов немедленно после постановки реакции

   с измерением оптической  плотности  (ОП)  раствора  субстрата  при

   длине волны 492 нм.

       Выведение спектрофотометра  на   нулевой   уровень   ("бланк")

   осуществляют   по   воздуху.  Учет  результатов  реакции  проводят

   согласно методике и цифровым данным,  изложенным в  инструкции  по

   применению,   имеющейся   в   каждом   используемом   наборе.  При

   автоматическом учете  результатов  реакции  по  величине  цифровых

   показателей   ОП   в   лунках  с  испытуемыми  образцами  судят  о

   концентрации специфических антител в исследуемой сыворотке крови и

   ликворе.  В  связи с этим данный метод оценки результатов называют

   количественным. При каждой постановке ИФА рассчитывают критическое

   значение  ОП  (ОПкрит.)  и  "серую  зону".  "Серой зоной" является

   интервал от ОПкрит.  - 10%  до ОПкрит.  + 10%. Исследуемый образец

   учитывают  как положительный,  если ОП данного образца выше "серой

   зоны",  как сомнительный,  если ОП  находится  в  пределах  "серой

   зоны",  и  как  отрицательный,  если  ОП  ниже  "серой зоны".  Так

   учитывают результаты во всех тест - системах, кроме тест - системы

   "ЛюисСкрин".  В  тест  - системе "ЛюисСкрин" исследуемая сыворотка

   расценивается  как  положительная,  если  ее   ОП   превышает   ОП

   отрицательного контроля не менее, чем в 2 раза.

       К сожалению,  при учете результатов реакции  все  ИФА  тест  -

   системы  невозможно  привести  к единому стандарту.  Один и тот же

   образец может давать в разных тест -  системах  совершенно  разный

   уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции

   самой  тест  -  системы,  используемого   антигена,   концентрации

   конъюгата и др.,  а также от величины ОПкрит. Поэтому более точной

   оценкой результатов ИФА является титр  противотрепонемных  антител

   каждого   положительного   образца.   С  целью  определения  титра

   производят  последовательные   2-кратные   разведения   испытуемой

   сыворотки крови, давшей положительный результат. За титр принимают

   наибольшее разведение сыворотки,  дающее положительный  результат.

   Следовательно,  титр  является  количественным  показателем уровня

   специфических антител в данном образце и степени его позитивности.

   Но  следует учитывать,  что повторное исследование сыворотки крови

   должно осуществляться с той же  тест  -  системой,  так  как  титр

   антител  в   одном и том  же  образце  может  быть  различным  при

   использовании разных тест - систем.

       При применении  тест - системы с визуальным учетом результатов

   также рекомендуется определение титров противотрепонемных  антител

   в резко положительных сывороточных образцах (4+).

       Отрицательной чертой  количественного  метода  исследования  с

   целью  определения  титра  антител  в  сыворотке  крови  и ликворе

   является  его  неэкономичность.  В  связи  с  этим   целесообразно

   использовать   другой  критерий  для  характеристики  концентрации

   антител  -  коэффициент  позитивности   (КП),   равный   отношению

   оптической   плотности,   полученной   для   каждого   образца,  к

   критической  оптической  плотности:   КП   =   ОП/ОПкрит.   КП   у

   положительных  образцов  выше  1,1,  сомнительных  -  находится  в

   интервале от 0,9 до 1,1 и отрицательных - ниже 0,9. Определение КП

   целесообразно проводить при выяснении динамики выработки антител у

   пациента в процессе наблюдения за ним после лечения сифилиса,  при

   этом обязательно нужно использовать ту же тест - систему, что и до

   лечения  больного.  Эта   методика   не   требует   дополнительных

   финансовых затрат и дает представление об эффективности лечения.

       При использовании  тест   -   системы   иммуноферментной   для

   качественного выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке

   крови человека ("АТ-Треп.-ИФТС",  г.  Ставрополь) возможен  только

   визуальный учет результатов реакции.  При резко положительном (4+)

   результате субстратная смесь имеет темно -  коричневый  цвет,  при

   положительном (3+) -  коричневый  цвет,   при   слабоположительном

   (2+) -  светло  -  коричневый,  при отрицательном (+,-) - светло -

   бежевый цвет или бесцветна.

       Образцы, для   которых    получен    сомнительный    результат

   (соответствующая  им  ОП  находится в пределах "серой зоны" и КП в

   интервале  от  0,9  до  1,1)  подлежат  повторному  анализу.   При

   повторном  сомнительном  результате  рекомендуется  анализ с новой

   порцией крови, взятой через 3-7 дней.

  

        МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ ИФА ДЛЯ ЛИКВОРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

  

       Для ликвородиагностики  сифилиса   могут   быть   использованы

   отечественные  тест  - системы ИФА,  предназначенные для выявления

   иммуноглобулинов класса О и работающие по первой схеме  проведения

   реакции. В настоящее время такими тест - системами являются:

       1. Тест - система иммуноферментная  для  выявления  антител  к

   Treponema   pallidum   в   сыворотке  или  плазме  крови  человека

   "РекомбиБест антипаллидум" и "РекомбиБест  антипаллидум  -  стрип"

   производства  ЗАО  "Вектор  -  Бест"  (п.  Кольцово  Новосибирской

   области); 2. Тест - система иммуноферментная для выявления антител

   к возбудителю сифилиса  "ИФА  -  АНТИ  -  LUIS"  производства  НПО

   "Диагностические системы" (г.  Нижний Новгород); 3. Тест - система

   иммуноферментная для  выявления  антител  к  возбудителю  сифилиса

   (Treponema  pallidum)Ha  основе рекомбинантных белков производства

   БТК "Биосервис" (г. Москва).

       Ликвор в реакцию вводят цельным и  неинактивированным.  Мутный

   или   с   примесью   крови   ликвор  центрифугируют  и  отсасывают

   надосадочную жидкость.  Перед исследованием ликвор можно сохранять

   в морозильном отделении холодильника при температуре от -12 град.С

   до  -18  град.  С  в  пробирках  под  резиновыми  пробками  или  в

   "эппендорфах" до 1 месяца. Размораживание производят при комнатной

   температуре.   Повторное   замораживание   и   размораживание   не

   допускается.

       При исследовании  ликвора  приготовление  рабочих   растворов,

   проведение  ИФА  и  учет результатов осуществляют в соответствии с

   инструкцией по применению тест - систем,  за исключением  пунктов,

   касающихся  разведения  ликвора  и приготовления рабочих растворов

   конъюгата.  Так,  исследование ликвора в отличие  от  исследования

   сыворотки  или плазмы крови проводят в первой фазе реакции при его

   разведении 1:2 (50 мкл ликвора и 50 мкл раствора для разведения) и

   во второй фазе реакции с рабочим раствором конъюгата, концентрация

   которого увеличена в 4 раза по сравнению с указанной в  инструкции

   для сыворотки или плазмы крови.

       Количественными показателями  концентрации  противотрепонемных

   антител   (степени   позитивности)   в   ликворе   являются   титр

   противотрепонемных   антител   или    коэффициент    позитивности.

   Определение  титров  или  коэффициентов позитивности целесообразно

   проводить как до лечения,  так и после него для выяснения динамики

   выработки антител с использованием одной и той же тест - системы.

       По своей диагностической эффективности  при ликвородиагностике

   сифилиса  ИФА  близок к РИФ-ц,  самой чувствительной и специфичной

   реакции при диагностике нейросифилиса.  Положительной  чертой  ИФА

   является   его   доступность  благодаря  наличию  производственных

   высококачественных тест - систем.

       Источники возникновения  ошибок  при  использовании ИФА-тест -

   систем делятся на вне- и внутрилабораторные.  К  первым относятся:

   нарушения техники взятия крови, условий транспортировки и хранения

   тест  -  систем  и  проб.  Ко  вторым  -   некачественная   работа

   лаборантов,  любые  отклонения  от инструкции по применению тест -

   системы,  неисправность инструментов  и  приборов,  неаккуратность

   ведения документации.

       Чтобы избежать   ошибок   при   проведении   ИФА,   необходимо

   придерживаться следующих правил:

       - не   использовать   для   исследования    хилезные,    резко

   гемолизированные    и   проросшие   сыворотки   крови,   добиваясь

   стандартных условий взятия и хранения образцов;

       - не  практиковать  2-кратного   и   более   замораживания   -

   размораживания образцов сыворотки крови;

       - не пользоваться просроченными наборами тест - систем;

       - соблюдать  стандартные  требования  к  чистоте  лабораторной

   посуды;   использовать   отдельные   посуду   и   наконечники  для

   автоматических пипеток (при  их  многократном  использовании)  для

   разведения конъюгатов и субстрата пероксидазной реакции (ОФД);

       - проводить периодический контроль качества работы лаборантов;

       - следить  за  строгим  соблюдением  инструкций  по применению

   тест - систем;

       - пользоваться   автоматическими   пипетками   с  погрешностью

   измерения объемов не более 5%,  ежемесячно проводя метрологический

   контроль их работы;

       - соблюдать      правила       эксплуатации       оборудования

   (спектрофотометры, автоматические промыватели планшет, рН-метры);

       - спектрофотометры для ИФА должны не реже одного  раза  в  год

   проходить   метрологический   контроль,   периодическому  контролю

   подлежат также автоматические пипетки, термостаты, рН-метры;

       - в    ходе   каждой   постановки   ИФА   заполнять   протокол

   исследования.

       Главным достоинством   ИФА   является  наличие  отечественного

   выпуска  тест  -  систем,   их   высокое   качество,   возможность

   автоматизации постановки и учета его результатов, что крайне важно

   при исследовании большого числа сывороток крови,  в  частности  от

   доноров.  При  использовании  тест  - систем ИФА для лабораторий с

   небольшим  объемом  работы  следует  закупать  тест  -  системы  с

   разборными планшетами (стрипы).

       ИФА диагностика  сифилиса  -  эффективный  метод.  Необходимым

   является  его более широкое использование в качестве скринингового

   и диагностического теста на  сифилис,  но  обязательным  при  этом

   должно быть  высокое  качество  выпускаемых  предприятием  тест  -

   систем. Недопустима продажа и использование в медицинской практике

   тест - систем,  не имеющих  утвержденной  фармакопейной  статьи  и

   разрешения    Минздрава   РФ   на   их   применение   в   практике

   здравоохранения. Все утвержденные и рекомендованные в практику ИФА

   тест  -  системы прошли государственные испытания в ГИСК им.  Л.А.

   Тарасевича и в ЦНИКВИ.  В процессе их промышленного выпуска должен

   осуществляться  систематический контроль качества.  К применению в

   медицинской практике разрешаются тест - системы,  чувствительность

   и специфичность которых не ниже 95%.

  

              ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИФА

  

       Дата анализа: ________________________________________________

       Исполнитель: _________________________________________________

       Тест - система: ______________________________________________

       Серия: ______ Контрольный N __________ Срок годности: ________

  

                             СХЕМА АНАЛИЗА:

  

   Љ””””’”””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’”””””’””””’””””Ї

   Ј    Ј 1 Ј  2 Ј  3 Ј  4 Ј  5 Ј  6 Ј  7 Ј  8 Ј  9 Ј  10 Ј 11 Ј 12 Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   АЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   ВЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   СЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   DЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   ЕЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   FЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   GЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   “””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤

   Ј   HЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

   ђ””””‘”””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘”””””‘””””‘””””‰

  

       РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА:

  

         РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ

                                СИФИЛИСА

  

       Принцип метода заключается в том, что при соединении сыворотки

   крови,  содержащей   специфические   антитела,   с   эритроцитами,

   сенсибилизированными  соответствующим  антигеном,  наблюдается  их

   характерная агглютинация.  Постановка реакции может осуществляться

   в пробирках или планшетах.

       Сенсибилизация эритроцитов при изготовлении тест - системы для

   диагностики   сифилиса   может   производиться   патогенными   или

   культуральными бледными трепонемами.

       Помимо наших  производителей,  ряд  зарубежных фирм поставляет

   свою продукцию в Россию.

       1. Гемагглютинационный     тест     для     качественного    и

   количественного  определения  антител  против  Treponema  pallidum

   ("Syphilis TPHA - test"),  фирма "Human", страна - производитель -

   Германия,  распространитель -  фирмы:  "Биохиммак",  "Лабораторная

   диагностика", г. Москва.

       2. Гемагглютинационный    тест     для     качественного     и

   количественного  определения  антител  против  Treponema  pallidum

   ("TPHA - nosticon"),  фирма "Organon",  страна -  производитель  -

   Голландия,  распространитель  -  фирма  "Organon  - technics",  г.

   Москва.

       3. Гемагглютинационный    тест     для     качественного     и

   количественного  определения  антител  против  Treponema  pallidum

   ("Syphilia  TPHA  200"),  фирма   "Sanofi   diagnostic   Pasteur",

   страна - производитель - Франция, распространитель - фирма "Sanofi

   diagnostic Pasteur", г. Москва.

       4. Гемагглютинационный     тест     для     качественного    и

   количественного  определения  антител  против  Treponema  pallidum

   ("Syphilis TPHA"),  фирма  "Randox",  страна  -  производитель   -

   Великобритания, распространитель - фирма ЗАО "Protea", г. Москва.

       5. Диагностикум  для  выявления антител к Treponema pallidum в

   реакции  пассивной  гемагглютинации  ("Люис  РПГА  тест"),   фирма

   "Ни-армедик Плюс", г. Москва.

       В ЦНИКВИ на большом материале с  отечественным  диагностикумом

   изучена  результативность  РПГА  по сравнению с другими тестами на

   сифилис при исследовании  сывороток  крови  больных  с  различными

   формами сифилиса до лечения.  В РПГА получено 99,4%  положительных

   результатов, в РИФ-абс - 99,1%, РИФ-200 - 99,1%, РИТ - 87,7%, МР -

   95,8%,   в   РСК   с   трепонемным   антигеном   -  95,8%,  РСК  с

   кардиолипиновым антигеном - 90,2%. В зарубежной литературе имеются

   указания  на  более  позднюю выработку гемагглютининов у больных в

   ранний период заболевания,  хотя в ЦНИКВИ выявлен высокий  процент

   положительных результатов при сифилисе первичном, серопозитивном -

   97,7%.

       Общее мнение   исследователей  заключается  в  том,  что  РПГА

   является ценным диагностическим тестом при всех  формах  сифилиса,

   но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания.

       Существует микро- и  макромодификации  постановки  РПГА,  чаще

   используется  первая  из-за  экономичности,  быстроты постановки и

   учета результатов.  Кроме того, есть качественный и количественный

   варианты постановки.  Последний позволяет определять титры антител

   в крови.  Но  при  этом,  необходимо  учесть,  что  при  повторных

   исследованиях  крови  в  РПГА необходимо использовать одну и ту же

   тест - систему.

       Результаты РПГА учитывают через 1,5-2 ч при микрометоде или на

   следующий день при макрометоде.  Неподвижно стоящие пластины  даже

   при высыхании их содержимого сохраняют полученную картину:

       "4+" - положительная РПГА. Эритроциты равномерно выстилают всю

   поверхность  лунки  (в  виде зонтика).  "3+" - положительная РПГА.

   Эритроциты  выстилают  всю  поверхность   лунки,   но   часть   их

   соскальзывает к центру.

       "2+" - слабоположительная РПГА.  Эритроциты образуют пленку на

   небольшом участке нижней части лунки.

       "1+" - отрицательный результат РПГА.  На дне лунки  эритроциты

   образуют рыхлый осадок.

       "-" - отрицательная РПГА. Эритроциты ровным плотным "колечком"

   или   "пуговкой"   лежат  на  самом  дне  лунки  (без  окружающего

   зернистого осаждения).

       Испытание сыворотки  крови  людей  в  первых  двух разведениях

   позволяет при качественной постановке реакции быстро выявлять лиц,

   сыворотки   крови   которых   содержат  специфические  антитела  к

   антигенам   бледной   трепонемы.   Испытание    сыворотки    крови

   количественным   методом  с  помощью  двукратных  разведений  дает

   дополнительную информацию о концентрации специфических  антител  в

   крови.

  

              Материально - техническое обеспечение метода

  

       Для постановки   РПГА  в  лаборатории  должно  быть  следующее

   оборудование:   полистироловые   пластины,   микротитраторы   типа

   "Такаччи",   холодильник,   центрифуга,  термостат  (+37  град.С),

   пипетки дозаторы и градуированные пипетки,  лабораторная посуда  и

   рН-метр.

       При проведении  серологических  исследований  на  сифилис,   в

   частности  ИФА  и РПГА,  могут иметь место как ложноположительные,

   так и ложноотрицательные результаты реакций.

       Ложноположительные результаты    могут   быть   получены   при

   исследовании   сывороток   крови   пациентов   с   невенерическими

   трепонематозами,  за  счет  ревматоидного  фактора  и  перекрестно

   реагирующих с  трепонемным  антигеном  антител,  образующихся  при

   различных  системных  или индуцированных лекарствами и наркотиками

   нарушениях обмена,  из-за аномального уровня  иммуноглобулинов;  у

   новорожденных  детей  -  за счет образования в организме плода или

   ребенка  IgM-антител  к  IgG  матери,  что   осложняет   трактовку

   результатов и диагностику врожденного сифилиса. Ложноотрицательные

   результаты реакции могут быть обусловлены конкуренцией между  IgM-

   и IgG-антителами.

       К наиболее типичным техническим ошибкам при  постановке  РПГА,

   приводящим к получению недостоверных результатов,  следует отнести

   неточное разведение ингредиентов, нарушение температурного режима,

   времени  инкубации  реагентов,  сроков  нанесения  их  на планшет,

   несоответствие рН растворов  требуемым,  загрязнение  лабораторной

   посуды.

       Образцы, давшие сомнительный результат в РПГА из-за содержания

   неспецифических агглютининов,  можно подвергнуть обработке с целью

   адсорбции этих  агглютининов.  Для  этого  20  мкл  сыворотки  при

   постановке   микромодификации   тщательно   смешивают   с  0,5  мл

   контрольных эритроцитов,  инкубируют 30 минут и  центрифугируют  5

   минут. Надосадочную жидкость подвергают повторному исследованию.

       Для постановки  РПГА,  как  и  других  серологических  тестов,

   должны   быть   выделены  врачи,  лаборанты,  медицинские  сестры,

   прошедшие  специальную  подготовку  по  соответствующему  вопросу.

   Подготовка врачей - серологов и повышение их  квалификации  должны

   осуществляться в кожно - венерологических учреждениях,  а также на

   кафедрах микробиологии и лабораторной  клинической  диагностики  в

   структурах последипломного образования врачей.

       При постановках  ИФА  и  РПГА  должны соблюдаться общепринятые

   мероприятия по технике  безопасности.  Антиген  для  этих  реакций

   непатогенен   (консервация).  Контрольные  сыворотки,  входящие  в

   состав наборов,  инактивированы и также содержат  консервант.  Его

   содержат  и  другие  компоненты наборов,  в связи с чем необходимо

   избегать их контакта с кожей и слизистыми  оболочками.  Испытуемые

   сыворотки  крови при постановке всех серологических тестов следует

   рассматривать  как  потенциально  опасные  для  здоровья  человека

   (гепатит,  ВИЧ-инфекция  и  др.).  При  работе с сыворотками крови

   необходимо  использовать  резиновые  перчатки,   не   пипетировать

   сыворотку ртом, все промывные растворы обрабатывать 5-6% раствором

   хлорамина или 6%  раствором перекиси водорода в течение 3-х  часов

   при  температуре  18-25град.С;  все  твердые  отходы  сбрасывать в

   спецконтейнер  с   пломбируемой   крышкой   и   затем   подвергать

   автоклавированию,  инструменты  и  оборудование  до и после работы

   протирать  70%  этиловым  спиртом.  Анализ  исследуемых   образцов

   следует проводить на рабочем месте, оборудованном в соответствии с

   требованиями,   предусмотренными   для   работы   с   инфекционным

   материалом.

       Подробности постановки ИФА и РПГА  описаны  в  соответствующих

   Пособиях (М., 1998,1999).

  

             РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ

                  СЕРО- И ЛИКВОРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

  

       Принцип метода   заключается   в   соединении   специфического

   комплекса  антиген  -  антитело с иммунной антивидовой сывороткой,

   меченной флюорохромом,  и выявление его с помощью  люминесцентного

   микроскопа.

  

             Материально - техническое обеспечение метода:

  

       люминисцентный микроскоп с ртутно - кварцевой лампой  ДРШ-250,

   термостат, инактиватор.

  

                     МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ - АБС

  

       Ингредиенты:

       1. Испытуемая  сыворотка крови.  Кровь для получения сыворотки

   крови берут из локтевой вены в чистую и сухую пробирку в объеме  5

   мл  и обрабатывают так же,  как для постановки реакции Вассермана.

   Инактивируют сыворотки крови однократно при температуре 56 град. С

   в   течение  30  минут.  В  связи  с  тем,  что  РИФ-абс  ставится

   нестерильно,  использование стерильной посуды,  соблюдение условий

   стерильности  при  хранении  сывороток  крови не обязательно.  Оно

   имеет значение только для более длительного  сохранения  сывороток

   крови до исследования.

       2. Антиген.  В качестве антигена используют взвесь  патогенных

   бледных  трепонем  штамма  Никольса из 7-суточного орхита кролика.

   Здоровых кроликов - самцов с отрицательными  результатами  реакции

   Вассермана  и  РИТ  заражают интратестикулярно и при возникновении

   орхита извлекают из яичек бледные трепонемы так же,  как в  случае

   получения  антигена  для  РИТ.  Полученную взвесь бледных трепонем

   сливают с кусочков яичка в стерильные пробирки с ватными  пробками

   и оставляют  в  холодильнике  при 4 град.  С на сутки,  после чего

   отделяют от осадка и при тех же  условиях  сохраняют  весь  период

   использования.

       Получение и  хранение  антигена  требует  соблюдения   условий

   стерильности,  т.  к.  с  одним  и  тем же антигеном реакция может

   ставиться в течение 2-4 месяцев.  Для антигена следует выбирать ту

   взвесь,  в  которой не наблюдается агглютинация трепонем и имеется

   достаточное их количество. Антиген может быть получен в ампулах из

   других лабораторий. Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо

   перемешивают и исследуют в микроскопе с конденсором  темного  поля

   зрения   для   определения  ее  густоты.  Для  постановки  РИФ-абс

   необходимо иметь взвесь,  содержащую 40-60 трепонем в темном  поле

   зрения, при наличии более густой взвеси ее необходимо развести.

       3. Сорбент.  В  качестве  сорбента  для  РИФ-абс  может   быть

   использован  ультраозвученный  трепонемный  антиген  для  РСК.  Он

   представляет   собой   разрушенную   ультразвуком   взвесь   смеси

   культуральных бледных трепонем штаммов V, VII, VIII, IX и Рейтера.

       Каждая серия  сорбента  перед  использованием  в  РИФ-  абс  с

   диагностической целью должна быть оттитрована.

       Титрование сорбентов.  Сорбенты титруют на 10 сыворотках крови

   больных  сифилисом,  дающих  в  РИФ-5 с буфером резко (4+) и слабо

   (2+) положительный результат,  а также на 20 сыворотках крови лиц,

   свободных от сифилитической инфекции, дающих в РИФ-5 отрицательный

   результат,  а также неспецифическую позитивность (2+ и более). При

   этом  для  РИФ-5  с  буфером люминесцирующая сыворотка должна быть

   оттитрована также,  как для РИФ-абс с ее разведением от  1:100  до

   1:140.

       Пример определения титра сорбента.  Цельный сорбент,  разводят

   фосфатным  буфером,  РН=7,2  в  2,  3,  4  раза  и более.  Берут 3

   сыворотки крови от больных сифилисом, одна из которых дает в РИФ-5

   резкоположительный (4+) результат,  две - слабоположительный (2+),

   и  5  сывороток  крови  от  людей,  свободных  от   сифилитической

   инфекции, 3 из которых дают неспецифические результаты в РИФ-5 (2+

   и  более).  Все  сыворотки  крови  разводят  в  5  раз  сорбентом,

   разведенным  в  свою  очередь  в  2,  3,  4  и более раз фосфатным

   буфером.  Затем сыворотки крови исследуют в реакции.  После  учета

   результатов    выбирают    разведение    сорбента,   при   котором

   сорбированные сыворотки крови больных сифилисом сохраняют  степень

   позитивности, аналогичную    полученной   с   сыворотками   крови,

   разведенными фосфатным буфером,  а сыворотки крови лиц,  свободных

   от  сифилитической  инфекции,  не  дают  свечения.  Это разведение

   сорбента является его титром.

       Титром сорбента  в  данном случае явилось разведение 1:3,  при

   котором все сыворотки крови больных  сифилисом  сохраняли  степень

   позитивности,  полученную  в  контроле,  и  в  то же время надежно

   снималась неспецифическая позитивность несифилитических  сывороток

   крови.

       Окончательный титр устанавливают в результате исследования  30

   сывороток крови больных сифилисом и контрольных лиц.

  

                                                         Таблица N 13

  

                     РЕЗУЛЬТАТЫ ТИТРОВАНИЯ СОРБЕНТА

  

   Љ”””””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї

   ЈИспытуемые сыворотки Ј            Результаты РИФ-5              Ј

   Ј       крови         “”””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””¤

   Ј                     ЈРазведение ЈРазведение сывороток крови 1:5Ј

   Ј                     Јсывороток  Ј    сорбентом в разведении    Ј

   Ј                     Јкрови 1:5  “”””””””””’”””””””””’””””””””””¤

   Ј                     Јбуфером (К)Ј   1:2   Ј   1:3   Ј  1:4     Ј

   “”””””””””””””””””””””•”””””””””””•”””””””””•”””””””””•””””””””””¤

   ЈСыворотки крови боль-Ј           Ј         Ј         Ј          Ј

   Јного сифилисом       Ј           Ј         Ј         Ј          Ј

   Ј       N 1           Ј   4+      Ј    3+   Ј    4+   Ј  4+      Ј

   Ј       N 2           Ј   2+      Ј    1+   Ј    2+   Ј  2+      Ј

   Ј       N 3           Ј   2+      Ј    -    Ј    2+   Ј  2+      Ј

   “”””””””””””””””””””””•”””””””””””•”””””””””•”””””””””•””””””””””¤

   ЈНесифилитическая сы- Ј           Ј         Ј         Ј          Ј

   Јворотка крови        Ј           Ј         Ј         Ј          Ј

   Ј       N 1           Ј   3+      Ј    -    Ј    1+   Ј  2+      Ј

   Ј       N 2           Ј   2/3+    Ј    -    Ј    -    Ј  2+      Ј

   Ј       N 3           Ј   2+      Ј    -    Ј    -    Ј  2+      Ј

   Ј       N 4           Ј   2+      Ј    -    Ј    -    Ј  2+      Ј

   Ј       N 5           Ј   -       Ј    -    Ј    -    Ј  -       Ј

   ђ”””””””””””””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””‘”””””””””‘””””””””””‰

  

       4. Антивидовая люминесцирующая сыворотка.  Для исследования  в

   РИФ  -  абс сывороток крови людей необходима меченная флюорохромом

   сыворотка крови  животных,  иммунизированных  сывороточным  белком

   человека.    Лиофильно    высушенную   люминесцирующую   сыворотку

   растворяют при соблюдении условий стерильности в  дистиллированной

   воде в том объеме,  который указан на этикетке ампул, переливают в

   стерильную  пробирку   с   резиновой    пробкой   и   в   процессе

   использования хранят при 4 град. С в течение 1-2 месяцев.

       В день постановки реакции  нужное  количество  этой  сыворотки

   разводят  по  титру дистиллированной водой.  Указанное на этикетке

   рабочее разведение сыворотки не годится для постановки  реакции  с

   целью   серодиагностики   сифилиса,   поэтому  титр  каждой  серии

   необходимо определять заново.

       Титрование антивидовой   люминесцирующей  сыворотки.  Берут  5

   сывороток крови больных сифилисом и  5  сывороток  крови  здоровых

   людей, разводят их в 5 раз сорбентом (с учетом его титра) и ставят

   реакцию  с  использованием  во  II   фазе   различных   разведений

   люминесцирующей  сыворотки против сывороточных глобулинов человека

   той серии,  титр которой определяется.  Следует учесть,  что  титр

   люминесцирующих  сывороток,  выпускаемых в настоящее время ИЭМ им.

   Н.  Ф.  Гамалеи,  колеблется при постановке РИФ - абс от 1:100  до

   1:140.  При  учете  реакции предварительным титром люминесцирующей

   сыворотки  следует  считать  то  разведение,   при   использовании

   которого  с  положительными  сыворотками  крови  получено  хорошее

   свечение  трепонем,  а  с  отрицательными  свечение  антигена   не

   получено.  Большее разведение люминесцирующей сыворотки, чем титр,

   приводит к понижению  чувствительности  реакции,  а  меньшее  -  к

   снижению  специфичности.  После определения предварительного титра

   следует  его   уточнить   на   большем   числе   положительных   и

   отрицательных сывороток крови.  Окончательным титром можно считать

   тот,  который проверен на 100 сыворотках крови,  причем из них  не

   менее 20 должно быть от больных сифилисом.

       Для предотвращения    пророста    после    разведения    сухой

   люминесцирующей  сыворотки дистиллированной водой к ней необходимо

   добавить мертиолат из расчета 1 объема его  раствора  1:1000  к  9

   объемам  люминесцирующей сыворотки.  При взятии новых ампул той же

   серии титр следует только проверить  и  уточнить  на  10  заведомо

   положительных и отрицательных сыворотках крови.

       Пример определения  предварительного   титра   люминесцирующей

   антивидовой сыворотки.  Готовят 60 препаратов, нумеруют их от 1 до

   60.  Берут 10 сывороток крови -  5  от  больных  сифилисом,  5  от

   здоровых  людей.  Все сыворотки крови разводят в 5 раз разведенным

   по титру сорбентом.

       На пронумерованные 1-10,  11-20,  21-30,  31-40,  41-50, 51-60

   препараты наносят в I фазе реакции  одни  и  те  же  10  сывороток

   крови,  разведенных в 5 раз сорбентом.  Во II фазе реакции на 1-10

   препараты наносят люминесцирующую сыворотку, разведенную 1:100, на

   11-20  -  1:110,  на  21-30 - 1:120,  на 31-40- 1:130,  на 41-50 -

   1:140, на 51-60 - 1:150.

       Оптимальным следует  считать разведение,  при котором свечение

   антигена будет хорошим при  постановке  реакции  с  положительными

   сыворотками крови и не будет наблюдаться с отрицательными.

  

                     ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ РИФ - АБС

  

       Из антигена  готовят препараты на тонких,  хорошо обезжиренных

   предметных  стеклах,  на  обратной  стороне  которых   стеклорезом

   обозначены  кружки диаметром 0,7 см (по 10 кружков на 1 предметном

   стекле).  В пределах кружка,  на стекло наносят антиген  -  взвесь

   бледных трепонем.  Запаянным концом пастеровской пипетки круговыми

   движениями взвесь распределяют в пределах  кружка,  высушивают  на

   воздухе  и  фиксируют  10 минут в химически чистом ацетоне.  Затем

   препараты нумеруют.  Инактивированные испытуемые  сыворотки  крови

   разводят   в  5  раз  сорбентом,  разведенным  по  титру  буферным

   раствором.  В штатив помешают ряд пробирок,  число и номер которых

   соответствует   числу  и  номеру  испытуемых  сывороток  крови.  В

   пробирки пипеткой разливают разведенный по титру  сорбент  по  0,2

   мл,  затем добавляют по 0,05 мл цельной испытуемой сыворотки крови

   и  хорошо   перемешивают.   Разведение   сыворотки   крови   можно

   осуществлять    аппаратом   Флоринского.   Разведенные   сорбентом

   сыворотки крови наносят на антиген так,  чтобы равномерно  покрыть

   мазок,  и препараты помещают во влажную камеру,  которую закрывают

   крышкой и помещают на 30 минут в термостат при 37 град.  С (I фаза

   реакции).  После  первой  фазы  препараты  осторожно промывают в 2

   порциях фосфатного  буфера,  причем  во  вторую  порцию  препараты

   помещают на 10 минут,  высушивают, после чего их вновь помещают во

   влажную  камеру,  наносят  разведенную  по  титру  люминесцирующую

   сыворотку  и  оставляют  при комнатной температуре на 30 минут (II

   фаза  реакции).  По  окончании  второй  фазы  препараты  промывают

   фосфатным  буфером,  как  описано  выше,  высушивают  и наносят на

   поверхность мазков по капле нелюминесцирующего иммерсионного масла

   (диметилфталата).

       Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе

   с  ртутно  -  кварцевой  лампой  ДРШ-250  с иммерсионной системой,

   окуляром 4х или 5х, фильтрами СЗС-7 или 14, ФС-1, БС-8 и ЖС-18 или

   Т-2Н.  Учет  реакции  осуществляется путем оценки свечения бледных

   трепонем.  Положительными  в  РИФ-абс  считают  сыворотки   крови,

   которые дают  свечение на 4+,  3+ и 2+.  Блестящее зелено - желтое

   свечение оценивается на 4+,  яркое - 3+,  слабое  свечение  -  2+.

   Отрицательными  считают сыворотки крови,  которые дают свечение на

   1+ (трепонемы в препарате окрашены интенсивнее фона) или  не  дают

   его.

       В каждой постановке РИФ-абс необходимо использовать  следующие

   контроля:

       Резкоположительный контроль.    Сыворотка    крови    больного

   сифилисом,  дающая  свечение на 4+ при разведении буфером в 5 раз.

   При разведении в 5 раз сорбентом сыворотка крови не должна  терять

   степень позитивности более чем на 1+.

       Слабоположительный контроль. Цельная или разведенная сыворотка

   крови больного сифилисом,  дающая слабую степень свечения антигена

   на 2+ при разведении буфером в 5  раз.  При  разведении  сорбентом

   позитивность ее должна сохраняться.

       Неспецифический контроль.  Несифилитическая  сыворотка  крови,

   дающая  при  разведении  буфером  флюоресценцию  не менее 2+.  При

   разведении сорбентом позитивность ее должна быть ликвидирована.

       Контроли антигена,  сорбента,  люминесцирующей сыворотки могут

   ставиться только при использовании новых серий этих ингредиентов.

  

            МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ-АБС С КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВЬЮ

  

       Постановка РИФ-абс возможна не только с сывороткой крови, но и

   с   кровью,  взятой  из  пальца.  Эту  модификацию  РИФ-абс  можно

   использовать при обследовании  на  сифилис  детей,  при  трудности

   получения  крови  из  вены  у взрослых,  при массовом обследовании

   различных контингентов на сифилис.

       При постановке  РИФ-абс  с  кровью применяют те же ингредиенты

   реакции, что и при постановке РИФ-абс с сывороткой крови (антиген,

   сорбент,    люминесцирующая   сыворотка).   Титр   люминесцирующей

   сыворотки определяют по вышеизложенной схеме,  но  при  постановке

   реакции  с  кровью.  Кровь  для  исследования после прокола пальца

   пациента набирают микропипеткой до метки 0,1 мл, быстро выдувают в

   пробирку,  содержащую  0,3  мл  дистиллированной  воды,  тщательно

   перемешивают пипеткой и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный

   дистиллированной  водой.  Постановка  реакции с разведенной кровью

   возможна как в день взятия ее,  так и через 1-2  дня  при  условии

   хранения при 4 град. С

       Непосредственно перед постановкой  реакции  ко  всем  образцам

   крови,  включенным  в  постановку  реакции,  добавляют  по  0,1 мл

   цельного сорбента, перемешивают пипеткой и встряхиванием, помещают

   на 30 минут в термостат при 37 град.  С. Затем кровь, обработанную

   сорбентом,  наносят на мазки антигена и  помещают  ее  во  влажную

   камеру при  37  град.  С  (I  фаза  реакции).  По  истечении срока

   экспозиции препараты промывают в первой порции  фосфатного  буфера

   так,  чтобы на стеклах не осталось следов крови,  и помешают их на

   10  минут  во  вторую  порцию  буфера.  После  высушивания  мазков

   проводят   II   фазу   реакции.  При  этом  на  препараты  наносят

   разведенную по титру,  установленному для данной модификации  РИФ,

   люминесцирующую сыворотку  против  глобулинов человека.  Стекла во

   влажной камере вновь помещают в термостат при 37 град. С.

       Через 30   минут   препараты   вновь  промывают  в  2  порциях

   фосфатного буфера в течение 10 минут,  высушивают и монтируют  для

   люминесцентной   микроскопии.   Исследование   препаратов  и  учет

   результатов реакции проводят так же,  как при постановке РИФ-абс с

   сывороткой крови.

  

                      МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ-200

  

       Методика постановки  РИФ-абс и РИФ-200 близки.  При постановке

   РИФ-200  обработка  испытуемых  сывороток   крови,   приготовление

   антигена,  подготовка  антивидовой  люминесцирующей сыворотки и ее

   титрование производят так же,  как при постановке РИФ-абс. Следует

   учесть только,  что титры люминесцирующей сыворотки, выпускаемой в

   настоящее время, в РИФ-200 колеблются от 1:20 до 1:50.

       Техника постановки   РИФ-200.   Испытуемые   сыворотки   крови

   разводят в 200 раз фосфатным буфером.  Для этого в штатив помещают

   3   ряда  пробирок,  число  и  нумерация  которых  в  каждом  ряду

   соответствует числу  и  нумерации  испытуемых  сывороток  крови  в

   рабочем журнале. В первом ряду налиты цельные испытуемые сыворотки

   крови,  во втором ряду в пробирки наливают по 0,45  мл  буфера,  в

   третьем  -  по  0,95 мл буфера.  Во втором ряду готовят разведение

   сывороток крови в 10 раз, для чего из каждой пробирки первого ряда

   отдельной  1  мл  градуированной пипеткой берут 0,05 мл испытуемой

   сыворотки крови, переносят в соответствующую пробирку второго ряда

   и  смешивают  с имеющимся там буфером.  Из каждой пробирки второго

   ряда той же самой пипеткой переносят по 0,05 мл разведенной уже  в

   10  раз  испытуемой  сыворотки  крови  в  соответствующую пробирку

   третьего ряда и получают разведение в 200 раз.

       При постановке   реакции   на  помещенные  во  влажную  камеру

   препараты наносят разведенные в 200 раз испытуемые сыворотки крови

   так,  чтобы их номера,  обозначенные на пробирках, соответствовали

   номерам  на  предметных  стеклах.  После  нанесения  на  препараты

   сыворотки  крови влажную камеру помещают на 30 минут в термостат с

   температурой 37 град.  (I фаза реакции). Затем препараты промывают

   10  минут  в  2 порциях буфера и высушивают.  После этого их вновь

   помещают во влажную камеру и на все наносят разведенную  по  титру

   люминесцирующую сыворотку (II фаза реакции).  Вторую фазу проводят

   30 минут при комнатной температуре,  после чего препараты 10 минут

   промывают, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии.

       Учет результатов РИФ-200 производят так же, как РИФ-абс.

       В том    случае,    когда    клиницистов    интересует    титр

   флюоресцирующих антител в  сыворотке  крови  больного,  РИФ-абс  и

   РИФ-200  следует ставить с последовательным разведением испытуемых

   сывороток  крови  и  титром  флюоресцирующих  антител  считать  то

   наибольшее разведение    сыворотки   крови,   которое   еще   дает

   положительный результат реакции.  Обозначать титр принято  числом,

   характеризующим  степень  разведения  испытуемой  сыворотки крови,

   например,  5,10,20,40 и т.  д.  (РИФ-абс) или 200,400, 800 и т. д.

   (РИФ-200).

       При постановке  обеих  модификаций  реакции   для   разведения

   испытуемых  сывороток  крови и для промывания препаратов после I и

   II фаз следует использовать фосфатный буфер следующего состава:  1

   л   дистиллированной   воды   6,8   г   натрия   хлорида,  1,48  г

   двузамещенного  фосфорнокислого  натрия,  0,43  г  однозамещенного

   фосфорнокислого калия (рН=7,2).  Приготовленный раствор хранят при

   комнатной температуре не более недели.

       В связи с возможностью получения отрицательных результатов при

   наличии флюоресцирующих антител не  следует  исследовать  кровь  и

   сыворотку  крови  в  РИФ-абс  и  РИФ-200  во время лечения больных

   пенициллином.

  

                       МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ-Ц

  

       Ранняя диагностика  поражений  нервной  системы  при  сифилисе

   является актуальным вопросом в деле борьбы с этим заболеванием.  В

   связи с тем, что РИФ-ц обладает большей чувствительностью, чем все

   другие  используемые  для  ликвородиагностики сифилиса тесты,  эта

   модификация  РИФ  может   быть   рекомендована   для   диагностики

   сифилитических  поражений  центральной  нервной  системы  при всех

   формах сифилиса.

       Для постановки    РИФ-ц    используют    тот    же    антиген,

   люминесцирующую сыворотку,  что и для постановки РИФ-абс и РИФ-200

   с  сывороткой крови.  Аналогичны также определение флюоресцирующих

   антител в ликворе и сыворотке крови и учет реакции.

       Спинномозговая жидкость  вводится в реакцию неинактивированной

   и цельной.  До постановки реакции ее можно сохранять в морозильном

   отделении  холодильника  в  пробирках под резиновыми пробками до 2

   недель. Оттаиванние производят при комнатной температуре.

       Техника постановки РИФ-ц.  В I фазе реакции на антиген наносят

   0,05  мл   неразведенной   испытуемой   спинномозговой   жидкости,

   препараты  помещают  во  влажную  камеру  на 30 минут при комнатой

   температуре.  Затем их промывают - фосфатным буфером,  рН = 7.2, в

   течение  10  минут,  высушивают.  Во  II фазе на препараты наносят

   разведенную по титру люминесцирующую  сыворотку,  которую  титруют

   при  постановке  реакции со спинномозговой жидкостью.  Выдерживают

   препараты при комнатной температуре 30 минут  во  влажной  камере,

   промывают, высушивают, монтируют для люминесцентной микроскопии.

  

       Источники ошибок:

       - несоблюдение условий  приготовления,  хранения  реагентов  и

   постановки реакции;

       - низкое  качество  люминесцирующей   сыворотки   и   неточное

   определение ее титра;

       - нанесение   исследуемого   материала   или   люминесцирующей

   сыворотки  при  постановке  реакции  не  на препарат,  а на другую

   сторону предметного стекла;

       - неправильная    установка    освещения    в   люминесцентном

   микроскопе;

       - низкое качество антигена.

  

          РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РЕАКЦИЯ ВАССЕРМАНА)

  

       Принцип:

       Реагины, находящиеся  в  сыворотке  крови  больных  сифилисом,

   обладают   свойством   вступать  в  соединение  с  кардиолипиновым

   антигеном.  Специфические  антитрепонемные  антитела  вступают   в

   соединение    со   специфическими   антигенами   (ультраозвученный

   трепонемный антиген).  Образовавшиеся комплексы антиген - антитело

   сорбируют вводимый в реакцию комплемент.  Индикация образовавшихся

   комплексов   достигается    введением    гемолитической    системы

   (гемолитическая сыворотка + эритроциты барана).

       Оборудование:

       - термостат с температурой 37 град. С;

       - холодильник с температурой 4 град. С;

       - инактиватор  (водяная или суховоздушная баня) с температурой

   56 град. С;

       - центрифуга;

       - пробирки размером 14х60 мм, 15х100 мм, 15х150 мм;

       - пипетки градуированные 1,2 мл с делениями на 0,01 мл;

       - пипетки градуированные 5,19 мл с делениями на 0,1 мл;

       - цилиндры  мерные емкостью 100,250,500,1000 мл с делениями на

   5 мл;

       - стаканы химические, емкостью 100,250,500 мл;

       - приборы   дозировочные   для   серологических   исследований

   (Флоринского) - ФЛ-3 и ФЛ-4.

  

       Ингредиенты

       1. 0,9% изотонический раствор натрия хлорида.

       2. Испытуемая сыворотка крови.

       Взятие крови производят натощак или не  ранее  6  часов  после

   приема   пищи.   Нельзя   брать   кровь  у  больных  с  повышенной

   температурой, после употребления спиртных напитков ранее 24 часов,

   перенесших  недавно  инфекционное  заболевание,  у женщин во время

   менструации,  беременных в последние 10 дней беременности, рожениц

   в  первые  10  дней  после  родов,  новорожденных в первые 10 дней

   жизни.

       Кровь из  локтевой  вены  в  количестве  7-10 мл берут в сухую

   чистую  пробирку.  Пункцию   производят   стерильной   иглой   при

   соблюдении правил асептики. У грудных детей кровь берут из надреза

   пятки узким скальпелем.

       В лабораторию кровь должна быть доставлена не позднее 48 часов

   с момента взятия при условии ее  хранения  в  холодильнике  при  4

   град. С.

       Сыворотка крови может быть использована для постановки реакции

   в день взятия крови.

       Доставленную в лабораторию кровь в день ее взятия  помещают  в

   термостат при  37 град.  С на 15-30 минут.  Образовавшийся сгусток

   отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки  и  центрифугируют

   15  минут  при  1000  об/мин.  Над  сгустком образуется прозрачная

   сыворотка крови,  которую при помощи пипетки с резиновым  баллоном

   без примеси эритроцитов переносят в другую пробирку. При наличии в

   сыворотке крови примеси эритроцитов ее центрифугируют  и  отделяют

   от  них.  Кровь,  доставленную  в  лабораторию накануне постановки

   реакции,  отделяют  стеклянной  палочкой  от  стенок  пробирки   и

   помещают в  холодильник при 4 град.  С.  Перед постановкой реакции

   образовавшуюся над сгустком крови  сыворотку  переносят  в  другую

   пробирку.

       Снятую со сгустка сыворотку крови инактивируют в суховоздушном

   инактиваторе или  водяной  бане в течение 30 минут при 56 град.  С

   для   уничтожения   естественного   комплемента   и   стабилизации

   глобулиновых фракций испытуемой сыворотки крови.

       Инактивированные сыворотки    крови    могут    храниться    в

   холодильнике   в   течение   5-6   дней.  Сыворотки  крови,  ранее

   инактивированные,  в день постановки реакции должны быть  повторно

   прогреты в течение 15 минут при 56 град.  С. Для более длительного

   хранения к  сыворотке  крови  после  инактивации  добавляют  сухую

   борную  кислоту  (из расчета 2%),  что позволяет ею пользоваться в

   течение  3-4  недель,  или  замораживают  в   морозильной   камере

   холодильника на тот же срок,  не допуская повторного замораживания

   и оттаивания.

       В случаях,   если   нельзя   немедленно  доставить  кровь  для

   исследования  в   лабораторию,   можно   пользоваться   высушенной

   сывороткой  крови.  Для  этого  2  мл  сыворотки крови без примеси

   эритроцитов наносят на сложенную вдвое вощаную бумагу, целлофан (8

   х 10 см) в виде четырех кружочков по 0,5 мл в каждом.  К сыворотке

   крови добавляют  по  3  капли  свежеприготовленного  40%  раствора

   пищевого  сахара  на  каждые  0,5 мл сыворотки.  Предварительно на

   вощаной бумаге, целлофане надписывают фамилию, имя, отчество, дату

   взятия   крови   и   объем  нанесенной  сыворотки  крови,  которую

   высушивают  при  комнатной  температуре.  Затем  вощаную   бумагу,

   целлофан  тщательно  свертывают  в  виде  аптечного  пакетика  и в

   конверте  по   почте   отправляют   в   ближайшую   серологическую

   лабораторию.  Такие  сыворотки  крови  должны  быть исследованы не

   позднее 5 дней с момента взятия крови в южных  районах  страны,  а

   также  в  летнее  время  года,  и  не позднее 10 дней на остальных

   территориях страны.

       В лаборатории  полученную высушенную сыворотку крови ссыпают в

   пробирку.  Для  ее  растворения  добавляют  изотонический  раствор

   натрия  хлорида,  восстанавливая  первоначальный  объем  сыворотки

   крови.  Сыворотка крови растворяется в течение одного часа стояния

   при комнатной температуре.  Затем ее инактивируют при 56 град. С в

   течение 30 минут,  после чего  она  может  быть  использована  для

   постановки реакции.

       Желтушные, хилезные,  резко   гемолизированные   и   проросшие

   сыворотки крови для исследования не пригодны.

       3. Антигены.

       Реакция Вассермана   должна   ставиться  с  двумя  антигенами:

   ультраозвученным трепонемным и кардиолипиновым.

       Ультраозвученный трепонемный  антиген  приготовлен  из культур

   бледных трепонем, подвергнутых действию ультразвука.

       Ультраозвученный трепонемный   антиген   выпускают   лиофильно

   высушенным во флаконах по 5 и 10 мл; хранят его в холодильнике при

   4 град.  С.  Срок  годности  антигена указан на этикетке.  Антиген

   растворяют  и  разводят  изотоническим  раствором  натрия  хлорида

   соответственно объему и титру, указанному на этикетке флакона.

       Кардиолипиновый антиген для  реакции  Вассермана  представляет

   собой  очищенный от балластных примесей спиртовый экстракт липидов

   из  мышц  бычьего  сердца.  Активность  антигена   обуславливается

   присутствием   трех   компонентов   -   фосфолипида,   лецитина  и

   холестерина.

       Кардиолипиновый антиген выпускается в ампулах по 2 мл;  хранят

   его в темном месте при  15-18  град.  С.  Срок  годности  антигена

   указан на этикетке.

       Перед употреблением антиген из ампулы переносят в сухую чистую

   пробирку,  плотно  закрывают  корковой  или  притертой  стеклянной

   пробкой.

       В случае  выпадения  кристаллов холестерина антиген необходимо

   прогреть на водяной бане при 56 град.  С или в термостате  при  37

   град. С до полного растворения кристаллов.

       Для постановки реакции антиген разводят соответственно  титру,

   указанному  на  этикетке  ампулы.  Разведенный антиген должен быть

   слегка опалесцирующим, но не мутным.

       Титр -  это  количество  чистого  антигена  в  1  мл раствора.

   Например,  если титр ультраозвученного трепонемного антигена 0,05,

   то  для  приготовления  10 мл разведенного по титру антигена нужно

   взять 0,5 мл антигена и  9,5  мл  изотонического  раствора  натрия

   хлорида.

       Двойные дозы антигенов  не  должны  обладать  гемотоксичностью

   (гемолиз    в   отсутствие   комплемента),   что   устанавливается

   соответствующим контролем  антигена  при  титровании  комплемента.

   Антигены   не   должны   быть   антикомплементарными   (подавление

   гемолиза),  что также устанавливают  при  параллельном  титровании

   комплемента без антигенов и в присутствии антигенов, применяемых в

   реакции связывания комплемента.

       4. Гемолитическая сыворотка (гемолизин)

       Это сыворотка   крови   кролика   или  осла,  иммунизированных

   эритроцитами барана.

       Гемолитическая сыворотка  (жидкая  или  сухая)  выпускается  в

   ампулах  по  1  мл  с  указанием  титра.  Для  растворения  сухого

   гемолизина  в ампулу добавляют 1 мл изотонического раствора натрия

   хлорида.  Гемолитическая сыворотка как сухая,  так и  растворенная

   хранится в  холодильнике  при  4  град.  С.  Срок  годности  сухой

   гемолитической сыворотки указан на этикетке.

       Титр используемой гемолитической сыворотки не должен быть ниже

   1:1200.  Определение титра производят по следующей схеме:  готовят

   основное  разведение  1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 9,9

   мл изотонического раствора натрия хлорида), из которого делают ряд

   соответствующих разведений (таблица N 1).

  

                                                          Таблица N 1

  

                      СХЕМА РАЗВЕДЕНИЙ ГЕМОЛИЗИНА

  

   Љ””””””””’”””””””””””””””””””””””’”””””””””””””””’”””””””””””””””Ї

   Ј    N   Ј       Гемолизин       ЈИзотонический  Ј  Разведение   Ј

   ЈпробирокЈ          (мл)         Јраствор натрия Ј  гемолизина   Ј

   Ј        Ј                       Ј   хлорида     Ј               Ј

   “””””””””•”””””””””””””””””””””””•”””””””””””””””•”””””””””””””””¤

   Ј    1   Ј  0,1 (не разведенный) Ј  9,9          Ј   1:100       Ј

   Ј    2   Ј  0,5 (1-го разведения)Ј  4,5          Ј   1:1000      Ј

   Ј    3   Ј       0,5 -//-        Ј  5,5          Ј   1:1200      Ј

   Ј    4   Ј       0,5 -//-        Ј  7,0          Ј   1:1500      Ј

   Ј    5   Ј       0,5 -//-        Ј  8,5          Ј   1:1800      Ј

   Ј    6   Ј       0,5 -//-        Ј  10,0         Ј   1:2100      Ј

   Ј    7   Ј       0,5 -//-        Ј  11,5         Ј   1:2400      Ј

   Ј    8   Ј       0,5 -//-        Ј  13,0         Ј   1:2700      Ј

   Ј    9   Ј       0,5 -//-        Ј  14,5         Ј   1:3000      Ј

   Ј   10   Ј       0,5 -//-        Ј  22,0         Ј   1:4000      Ј

   ђ””””””””‘”””””””””””””””””””””””‘”””””””””””””””‘”””””””””””””””‰

  

       Затем в  ряд  других  пробирок  отмеряют  по  0,5   мл   ранее

   приготовленных  разведений  гемолитической  сыворотки,  начиная  с

   1:1000,  добавляют по одному  мл  изотонического  раствора  натрия

   хлорида и 0,5 мл комплемента в разведении 1:10,  а также по 0,5 мл

   3%  взвеси эритроцитов барана (таблица N 2);  пробирки помещают  в

   термостат при 37 град.  С на 1 час,  периодически  встряхивая  2-3

   раза.

       Титром гемолитической   сыворотки   является   наивысшее    ее

   разведение, давшее полное растворение 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов

   барана  в  присутствии   комплемента.   В   данном   случае   титр

   гемолитической сыворотки - 1:1500 (таблица N 2).

       Для основного   опыта   и   титрования   ингридиентов    берут

   разведение, усиленное против полученного титра в три раза (тройной

   титр). В данном примере - 1:500 (0,1 на 50).

  

                                                          Таблица N 2

  

                      ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ГЕМОЛИЗИНА

  

   Љ”””””””””’”””””””””””’””””””””’””””””””’”””””””’””””””””””’”””””””””””””””’”””””””””Ї

   Ј    N    Ј РазведениеЈГемоли- ЈИзотони-ЈКомпле-Ј3% взвесь Ј               ЈРезультатЈ

   Јпробирок Ј гемолизинаЈзин в   Јческий  Јмент 10Јэритроци- Ј               Ј         Ј

   Ј  соотв. Ј           Јсоотв.  Јраствор Ј(мл)   Јтов баранаЈ               Ј         Ј

   Јтабл. N 1Ј           Јразведе-Јнатрия  Ј       Ј(мл)      Ј               Ј         Ј

   Ј         Ј           Јниях    Јхлорида Ј       Ј          Ј               Ј         Ј

   Ј         Ј           Ј(мл)    Ј        Ј       Ј          Ј               Ј         Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””•”””””””””””””””•”””””””””¤

   Ј    1    Ј  1:1000   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      ЈПоместить в    ЈГемолиз  Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤термостат при  “”””””””””¤

   Ј    2    Ј  1:1200   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј37 град. С на 1ЈГемолиз  Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤час.           “”””””””””¤

   Ј    3    Ј  1:1500   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј               ЈГемолиз  Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤               “”””””””””¤

   Ј    4    Ј  1:1800   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          ЈНалюдать ход   Јгемолиза Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤гемолиза через “”””””””””¤

   Ј    5    Ј  1:2100   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј15-30-60       ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Јминут          Јгемолиза Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤               “”””””””””¤

   Ј    6    Ј  1:2400   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Ј               Јгемолиза Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤               “”””””””””¤

   Ј    7    Ј  1:2700   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Ј               Јгемолиза Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤               “”””””””””¤

   Ј    8    Ј  1:3000   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Ј               Јгемолиза Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤               “”””””””””¤

   Ј    9    Ј  1:4000   Ј 0,5    Ј 1,0    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Ј               Јгемолиза Ј

   “”””””””””‘”””””””””””‘””””””””‘””””””””‘”””””””‘””””””””””‘”””””””””””””””‘”””””””””¤

   Ј            Контроли                                                                Ј

   “”””””””””’”””””””””””’””””””””’””””””””’”””””””’””””””””””’”””””””””””””””’”””””””””¤

   Ј   10    Ј  1:1000   Ј 0,5    Ј 1,5    Ј -     Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Ј               Јгемолиза Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤               “”””””””””¤

   Ј   11    Ј  1:1000   Ј -      Ј 1,5    Ј 0,5   Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Ј               Јгемолиза Ј

   “”””””””””•”””””””””””•””””””””•””””””””•”””””””•””””””””””¤               “”””””””””¤

   Ј   12    Ј  1:1000   Ј -      Ј 2,0    Ј -     Ј 0,5      Ј               ЈЗадержка Ј

   Ј         Ј           Ј        Ј        Ј       Ј          Ј               Јгемолиза Ј

   ђ”””””””””‘”””””””””””‘””””””””‘””””””””‘”””””””‘””””””””””‘”””””””””””””””‘”””””””””‰

  

       5. Эритроциты барана

       Баран должен быть в возрасте от 1 до 5 лет. Кровь у него берут

   путем  пункции  яремной  вены  не  чаще  одного раза в 10 дней,  в

   количестве не более 200 мл в сухую стерильную банку со стеклянными

   бусами,  которую  встряхивают  в  течение 5-10 минут.  Затем кровь

   фильтруют  через  двойной  слой  марли  (отделяют   образовавшиеся

   сгустки нитей фибрина).

       В день постановки реакции эритроциты барана трех -  пятикратно

   отмывают    изотоническим    раствором    натрия   хлорида   путем

   центрифугирования.  Центрифугируют  10  минут  при   3,0   тысячах

   оборотов в минуту.  Последнюю бесцветную порцию промывной жидкости

   сливают,  а осадок вновь центрифугируют при 1,5 тысячах оборотов в

   минуту для его уплотнения.  Надосадочную жидкость вновь удаляют, а

   из плотного  осадка  готовят  3%  взвесь  эритроцитов   барана   в

   изотоническом  растворе  натрия  хлорида  (на 3 мл плотного осадка

   эритроцитов  добавляют  97  мл  изотонического   раствора   натрия

   хлорида).  Отмытые  эритроциты  в  последующие  дни  в  работе  не

   используют.  При наличие гемолиза эритроциты барана к употреблению

   не пригодны.

       Дефибринированную кровь  сохраняют  в   широкогорлом   сосуде,

   накрытом  стерильной  двухслойной марлевой салфеткой в течение 5-7

   дней в холодильнике при 4 град. С.

       Для хранения  дефибринированной  крови барана длительное время

   рекомендуется консервировать ее по методу Мигулиной.  Для этого  к

   100  мл  дефибринированной  крови  барана  добавляют  15 мл смеси,

   приготовленной по следующей  прописи:  глюкозы  -  6,0  г,  борной

   кислоты  -  4,5 г,  100 мл изотонического раствора натрия хлорида;

   приготовленную смесь кипятят на водяной бане 3 дня  подряд  по  20

   минут.  Консервированная  кровь барана по методу Мигулиной годна к

   употреблению в течение 3-4 недель.  Перед постановкой реакции  при

   использовании   консервированной   крови   эритроциты   необходимо

   отмывать  изотоническим  раствором  натрия  хлорида  так  же,  как

   неконсервированной.

       6. Комплемент

       Применяют смесь сыворотки крови,  полученной пункцией сердца у

   5-10  здоровых  морских  свинок.  Кровь  для  лучшего  свертывания

   помещают в термостат при 37 град. С на 30 минут. После образования

   сгустка последний отделяют от стенок пробирки,  которую помещают в

   холодильник при 4 град. С до следующего дня.

       Полученную прозрачную сыворотку крови сливают и используют как

   комплемент.   Активность   этого   комплемента   при   хранении  в

   холодильнике при 4 град. С сохраняется в течение 1-2 суток.

       При консервировании   сухой   борной  кислотой  и  сернокислым

   натрием комплемент  сохраняется  в холодильнике при 4 град.  С 1-2

   месяца (4,0 г борной кислоты + 5,0 г сернокислого натрия на 100 мл

   комплемента).

       Может быть использован лиофильно высушенный комплемент.  Сухой

   комплемент выпускается в  ампулах  по  1  мл.  Растворение  сухого

   комплемента  производят  в  день  постановки реакции изотоническим

   раствором натрия хлорида при легком встряхивании. В ампулу с сухим

   комплементом   добавляют   1  мл  изотонического  раствора  натрия

   хлорида.  Нужное для  постановки  реакции  количество  комплемента

   смешивают из нескольких ампул одной серии.

       Непосредственно перед постановкой реакции Вассермана  проводят

   титрование    комплемента   в   присутствии   всех   ингредиентов,

   участвующих в опыте.

       Комплемент титруют   обязательно:   а)   в  чистом  виде  (без

   антигенов),  т.е. в присутствии только гемолитической системы и б)

   с  каждым  антигеном,  входящим  в  опыт.  Титрование  комплемента

   проводят  также  в  присутствии   инактивированной   отрицательной

   сыворотки крови человека.

       При титровании комплемента ингредиенты  разводят  в  следующем

   порядке:

       1. Разводят гемолитическую сыворотку  по  утроенному  титру  в

          изотоническом растворе натрия хлорида.

       2. Из   плотного   осадка  эритроцитов  готовят  3%  взвесь  в

          изотоническом растворе натрия хлорида.

       3. Разливают 3%  взвесь  эритроцитов  барана  и  изотонический

          раствор натрия   хлорида   в   5   контрольных  пробирок  и

          разведенную по утроенному  титру  гемолитическую  сыворотку

          (во второй контроль) - таблица N 3.

       4. Готовят  гемолитическую  систему:  раствор   гемолитической

          сыворотки, разведенной  по  утроенному  титру,  приливают к

          равному объему 3%  взвеси эритроцитов барана  и  производят

          быстрое  смешивание  путем  переливания  из  одной  колбы в

          другую.

          Полученную смесь помещают в термостат при 37 град.  С на 30

          минут для сенсибилизации эритроцитов.

       5. Разводят антигены изотоническим раствором натрия хлорида по

          указанному на этикетке титру.

       6. Разводят  заведомо отрицательную инактивированную сыворотку

          крови человека в соотношении 1:5 (2 мл сыворотки крови +  8

          мл изотонического раствора натрия хлорида).

       7. Разводят  комплемент  1:10  (1  мл  комплемента  +   9   мл

          изотонического раствора натрия хлорида).

  

                                                          Таблица N 3

  

                ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА В ОБЪЕМЕ 1,25 МЛ

  

   Љ”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї

   ЈИнгредиенты (мл) (общий объем - 1,25 мл) Ј         Контрольные пробирки         Ј

   Ј                                         “””””””’”””””””’”””””””’”””””””’”””””””¤

   Ј                                         Ј 1-я  Ј  2-я  Ј  3-я  Ј  4-я  Ј  5-я  Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””¤

   ЈГемолитическая сыворотка, разведенная по Ј  -   Ј  0,25 Ј   -   Ј   -   Ј   -   Ј

   Јутроенному титру                         Ј      Ј       Ј       Ј       Ј       Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””¤

   Ј3% взвесь эритроцитов барана             Ј 0,25 Ј  0,25 Ј  0,25 Ј  0,25 Ј  0,25 Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””¤

   ЈКомплемент 1:100                         Ј 0,25 Ј   -   Ј   -   Ј   -   Ј   -   Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””¤

   ЈИзотонический раствор натрия хлорида     Ј 0,75 Ј  0,75 Ј  1,0  Ј  0,5  Ј  0,5  Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””¤

   ЈАнтиген трепонемный, разведенный по титруЈ  -   Ј   -   Ј   -   Ј  0,5  Ј   -   Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””¤

   ЈАнтиген кардиолипиновый, разведенный по  Ј  -   Ј   -   Ј   -   Ј   -   Ј  0,5  Ј

   Јтитру                                    Ј      Ј       Ј       Ј       Ј       Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‘””””””‘”””””””‘”””””””‘”””””””‘”””””””¤

   Ј          Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. на 45 минут            Ј

   “”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤

   Ј             Результат                   Ј  --Г     --Г     -- Г     --Г   --Г  Ј

   Ј                                         “””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤

   Ј                                         ЈПосле 45 минут пребывания в термостатеЈ

   Ј                                         Јпри 37 град. во всех контрольных про- Ј

   Ј                                         Јбирках должен отсутствовать гемолиз   Ј

   Ј                                         Ј(--Г)                                 Ј

   ђ”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‘””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‰

  

       Титрование комплемента проводят в 30  пробирках,  поставленных

   по   10  штук  в  три  ряда.  Два  ряда  пробирок  для  титрования

   комплемента в присутствии  двух  антигенов  и  третий  ряд  -  для

   титрования  комплемента без антигенов.  Пять контрольных пробирок:

   две  -  для  контроля  антигенов  и  по  одной  -   для   контроля

   комплемента,  гемолитической  сыворотки  и изотонического раствора

   натрия хлорида  на  гемотоксичность  -  заполняют  до  объединения

   раствора  гемолитической  сыворотки  и  взвеси  эритроцитов барана

   (таблица N 3).

       Комплемент, разведенный  1:10,  разливают  в  десять  пробирок

   первого ряда в дозах:  0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44;

   0,5; 0,55 мл (таблица N 4).

  

                                                          Таблица N 4

  

            ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНА И

                 ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

  

   Љ”””””””””””””””””””””””’”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї

   ЈИнгредиент (мл)        Ј                NN пробирок                      Ј

   Ј(общий объем - 1,25 мл)“””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤

   Ј                       Ј 1  Ј 2  Ј 3  Ј 4  Ј 5  Ј 6  Ј 7  Ј 8  Ј 9  Ј10  Ј

   “”””””””””””””””””””””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””¤

   ЈКомплемент 1:10        Ј0,1 Ј0,16Ј0,2 Ј0,24Ј0,3 Ј0,36Ј0,4 Ј0,44Ј0,5 Ј0,55Ј

   “”””””””””””””””””””””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””¤

   ЈИзотонический раствор  Ј0,9 Ј0,84Ј0,8 Ј0,76Ј0,7 Ј0,64Ј0,6 Ј0,56Ј0,5 Ј0,45Ј

   Јнатрия хлорида         Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј

   “”””””””””””””””””””””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””¤

   Ј После тщательного перемешивания из каждой пробирки переносят по 0,25 мл Ј

   Јв соответственно стоящие сзади пробирки второго, третьего ряда и 0,25 мл Ј

   Ј                            выливают                                     Ј

   “”””””””””””””””””””””””’”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤

   ЈОтрицательная инактиви-Ј            По 0,25 мл во все 30 пробирок        Ј

   Јрованная сыворотка кро-Ј                                                 Ј

   Јви человека 1:5        Ј                                                 Ј

   “”””””””””””””””””””””””•””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤

   ЈАнтиген трепонемный,   Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј

   Јразведенный по титру   “””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””¤

   Ј                       Ј                Первый ряд пробирок              Ј

   “”””””””””””””””””””””””•””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤

   ЈАнтиген кардиолипино-  Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј

   Јвый, разведенный по    “””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””¤

   Јтитру                  Ј                Второй ряд пробирок              Ј

   “”””””””””””””””””””””””•””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤

   ЈИзотонический раствор  Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј0,25Ј

   Јнатрия хлорида         “””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””¤

   Ј                       Ј                Третий ряд пробирок              Ј

   “”””””””””””””””””””””””•””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤

   ЈГемолитическая система Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј

   Ј                       “””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””¤

   Ј                       Ј                Третий ряд пробирок              Ј

   “”””””””””””””””””””””””‘”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤

   Ј       Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут      Ј

   “”””””””””””””””””””””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤

   ЈГемолитическая система Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј0,5 Ј

   Ј                       “””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””¤

   Ј                       Ј                Первый и второй ряды             Ј

   •”””””””””””””””””””””””‘”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤

   Ј         Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут    Ј

   “”””””””””””””””””””””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤

   ЈРезультат              Ј--Г Ј--Г Ј--Г Ј--Г Ј +Г Ј +Г Ј +Г Ј +Г Ј +Г Ј +Г Ј

   ђ”””””””””””””””””””””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‰

  

       Примечание: --Г (задержка гемолиза); +Г (гемолиз)

  

       Общий объем   содержимого   пробирок   доводят   до    1    мл

   соответствующими  объемами изотонического раствора натрия хлорида:

   0,9; 0,84; 0,8; 0,76; 0,7; 0,64; 0,6; 0,56; 0,5; 0,45 мл.

       Полученную в  каждой  пробирке  смесь тщательно перемешивают и

   переносят по 0,25 мл в  соответственно  стоящие  позади  два  ряда

   пробирок и 0,25 мл выливают. Затем во все 30 пробирок разливают по

   0,25 мл инактивированной отрицательной сыворотки  крови  человека,

   разведенной изотоническим раствором натрия хлорида 1:5. Далее в 10

   пробирок первого ряда приливают по 0,25 мл разведенного  по  титру

   трепонемного   антигена;   разведенный  по  титру  кардиолипиновый

   антиген  приливают  по  0,25  мл  в  10  пробирок  второго   ряда;

   изотонический  раствор  натрия  хлорида  приливают по 0,25 мл в 10

   пробирок третьего ряда.

       Штатив с   пробирками   встряхивают  и  добавляют  по  0,5  мл

   гемолитической системы в  третий  ряд  пробирок  (без  антигенов).

   Штатив  с  пробирками  вновь  встряхивают и помещают на 45 минут в

   термостат при 37 град. С.

       После инкубации  в  термостате в 20 пробирок первого и второго

   рядов добавляют  по  0,5  мл  гемолитической  системы.  Содержимое

   пробирок вновь  встряхивают и помещают в термостат при 37 град.  С

   на 45  минут.  По  истечении  45  минут  определяют  рабочую  долю

   комплемента,  которая устанавливается следующим образом:  в основу

   берут титр комплемента без антигенов,  затем  титр  комплемента  в

   присутствии  антигенов,  к  которому  делают  надбавку  в пределах

   15-30%  (в среднем  20%)  в  зависимости  от  степени  гемолиза  в

   пробирках с меньшим количеством комплемента (таблица N 4).

       Титром комплемента   является   наименьшее   его   количество,

   способствующее  полному  гемолизу эритроцитов барана в присутствии

   антигена и отрицательной сыворотки крови человека.

       В данном  случае  титр  комплемента будет 0,3,  а рабочая доза

   комплемент 0,36, т.е. 3,6%.

       Для каждого    рабочего    дня   готовят   необходимый   объем

   комплемента,  разведенного по рабочей дозе, исходя из расчета 0,75

   мл  комплемента  на  каждую испытуемую сыворотку крови при условии

   постановки реакции Вассермана с  двумя  антигенами.  Так,  на  100

   испытуемых   сывороток   крови   необходимо   75  мл  комплемента,

   разведенного  по  рабочей   дозе.   Следовательно,   к   72,3   мл

   изотонического  раствора  натрия  хлорида  нужно  прибавить 2,7 мл

   комплемента.

       В случае  получения  разных  титров  комплемента в присутствии

   трепонемного  и  кардиолипинового  антигенов   используют   разные

   рабочие дозы комплемента в соответствии с полученными титрами.

  

          КАЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

  

       В день   постановки  опыта  проводят  подготовительную  работу

   (сливание испытуемых сывороток крови со сгустка,  их  инактивация,

   отмывание   эритроцитов  барана  от  плазмы  крови,  приготовление

   изотонического раствора  натрия  хлорида).  Разводят  ингредиенты:

   гемолитическую  сыворотку,  эритроциты барана,  антигены по титру.

   Определяют рабочую дозу комплемента титрованием без  антигенов,  в

   присутствии антигенов.

       Расход ингредиентов на 100 исследований:

       - натрий хлорид х.ч.                                 - 18 г;

       - кардиолипиновый антиген (РСК)                      - 0,1 мл;

       - ультраозвученный трепонемный антиген               - 2,5 мл;

       - комплемент                                         - 4,5 мл;

       - гемолитическая сыворотка                           - 0,3 мл;

       - эритроциты барана с плотного осадка                - 3,5 мл.

  

       Исследование каждой испытуемой сыворотки крови проводят в трех

   пробирках с двумя антигенами (таблица N 5). Одновременно исследуют

   для контроля  заведомо  положительные  (4+,  2+)  и  отрицательную

   сыворотки  крови.  Каждую  испытуемую  инактивированную  сыворотку

   крови,  разведенную 1:5 изотоническим  раствором  натрия  хлорида,

   разливают  по  0,25 мл в три пробирки,  из которых третья является

   контрольной.  В первую пробирку добавляют по 0,25 мл  трепонемного

   антигена,   во   вторую   -  0,25  мл  кардиолипинового  антигена,

   разведенных  по  титру.  В  третью   (контрольную)   -   0,25   мл

   изотонического раствора натрия хлорида.  Комплемент разведенный по

   рабочей дозе,  добавляют по 0,25 мл во все опытные  и  контрольный

   пробирки.  Предварительное  смешивание  антигена  и комплемента не

   рекомендуется.  После  первичной  45  -   минутной   инкубации   в

   термостате при  37  град.  С  добавляют  во все пробирки по 0,5 мл

   гемолитической   системы.   Легким   встряхиванием    перемешивают

   содержимое пробирок  и  помещают их в термостат при 37 град.  С на

   45-60  минут  до  наступления  полного  гемолиза   в   контрольной

   пробирке. Регистрируют результат реакции по наличию или отсутствию

   гемолиза в опытных пробирках.

  

       Оценка результатов

       Для обозначения  степени   позитивности   реакции   Вассермана

   пользуются системой четырех плюсов:

       Полная задержка гемолиза - 4+ (резко  положительная  реакция);

   значительная  задержка  гемолиза  -  3+  (положительная  реакция);

   частичная задержка гемолиза  -  2+  (слабоположительная  реакция);

   незначительная задержка гемолиза - 1+;  сомнительная реакция -+/-.

   Отрицательный результат реакции характеризуется  полным  гемолизом

   во всех пробирках опыта.

  

                                                          Таблица N 5

  

          КАЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

  

   Љ””””””””””””””””””””””””””””””’”””””””””””””””””””””””””””””””””Ї

   Ј       Ингредиенты (мл)       Ј           NN пробирок           Ј

   Ј   (общий объем - 1,25 мл)    “”””””””’”””””””””’”””””””””””””””¤

   Ј                              Ј  1    Ј    2    Ј  3 (контроль) Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈИспытуемая инактивированная   Ј 0,25  Ј   0,25  Ј     0,25      Ј

   Јсыворотка крови, разведенная  Ј       Ј         Ј               Ј

   Ј1:5                           Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈПоложительная инактивированнаяЈ 0,25  Ј   0,25  Ј     0,25      Ј

   Јсыворотка крови, разведенная  Ј       Ј         Ј               Ј

   Ј1:5                           Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈСлабоположительная инактивиро-Ј 0,25  Ј   0,25  Ј     0,25      Ј

   Јванная сыворотка крови, разве-Ј       Ј         Ј               Ј

   Јденная 1:5                    Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈОтрицательная инактивированнаяЈ 0,25  Ј   0,25  Ј     0,25      Ј

   Јсыворотка крови, разведенная  Ј       Ј         Ј               Ј

   Ј1:5                           Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈАнтиген трепонемный, разведен-Ј 0,25  Ј    -    Ј      -        Ј

   Јный по титру                  Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈАнтиген кардиолипиновый, раз- Ј -     Ј   0,25  Ј      -        Ј

   Јведенный по титру             Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈИзотонический раствор натрия  Ј -     Ј    -    Ј     0,25      Ј

   Јхлорида                       Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•”””””””””•”””””””””””””””¤

   ЈКомплемент, разведенный по    Ј 0,25  Ј   0,25  Ј     0,25      Ј

   Јрабочей дозе                  Ј       Ј         Ј               Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””‘”””””””‘”””””””””‘”””””””””””””””¤

   ЈВстряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут    Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””’”””””””’”””””””””’”””””””””””””””¤

   ЈГемолитическая система        Ј 0,5   Ј   0,5   Ј  0,5          Ј

   “””””””””””””””””””””””””””””””‘”””””””‘”””””””””‘”””””””””””””””¤

   ЈВстряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45-60 минут Ј

   Ј   до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке       Ј

   ђ””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‰

  

       Оценку результатов    регистрируют    в    книге    протоколов

   лаборатории.

       Результаты реакции  следует   давать   по   каждому   антигену

   отдельно.

       В случае расхождения результатов между  антигенами  необходимо

   повторить   исследование  новой  порции  сыворотки  крови.  Особое

   внимание следует  обращать  на  образцы  сыворотки  крови,  дающие

   положительный   результат   в   РСК   с  трепонемным  антигеном  и

   отрицательный  результат  с  кардиолипиновым  и  в  МР.  Поскольку

   трепонемный  антиген  является  специфическим  следует исследовать

   данную сыворотку крови в специфических тестах,  в частности в РПГА

   из-за простоты ее постановки и быстрого получения результата.

       После лечения больных по поводу  сифилиса  РСК  с  трепонемным

   антигеном,  как  и  другие  специфические тесты,  может длительное

   время оставаться позитивной.

       Повторное исследование  необходимо  также при наличии задержки

   гемолиза  в  контроле  сыворотки  крови   (третья   пробирка,   не

   содержащая  антигена).

       Правильность течения опыта оценивают  на  основании  следующих

   результатов:

       - контроля испытуемой сыворотки крови -  третий  ряд  пробирок

   (отрицательный);

       - контроля   с   заведомо   отрицательной   сывороткой   крови

   (отрицательный);

       - контроля  с   заведомо   положительной   (3+   или   4+)   и

   слабоположительной (2+) сыворотками крови.

       В качестве контрольных используют лиофилизированные  сыворотки

   крови.

       Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из

   крови кроликов, зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм

   Никольса), отрицательные - из крови здоровых кроликов.

       Сухие сыворотки  крови  выпускают  в  ампулах по 1 мл.  В день

   постановки  реакции   сыворотку   крови   растворяют   добавлением

   изотонического   раствора   натрия   хлорида   для  восстановления

   первоначального (до высушивания) объема.

       После полного  растворения  сыворотки  крови  инактивируют при

   56град. С в течение 30 минут.  Положительные и  слабоположительные

   сыворотки  крови  должны  давать  задержку  гемолиза  на  4+  и 2+

   соответственно  при  разведении  1:5  по   качественной   методике

   постановки  реакции  Вассермана  с  кардиолипиновым  и трепонемным

   антигенами.

       Если рабочая  доза  комплемента  выбрана  неправильно (избыток

   комплемента),  то  со слабоположительной  сывороткой  крови  будет

   получен    отрицательный   результат   реакции;   при   недостатке

   комплемента   наблюдается   задержка   гемолиза   с    контрольной

   отрицательной  сывороткой  крови и в контроле испытуемых сывороток

   крови (3-й ряд пробирок).

       Источники ошибок:

       - нарушение условий и методики постановки реакции;

       - несоблюдение  условий  и срока хранения испытуемой сыворотки

   крови, антигенов, комплемента, эритроцитов барана;

       - изменение процентного содержания натрия хлорида;

       - неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток  или

   недостаток его в опыте);

       - исключение из постановки реакции контрольных положительных и

   слабоположительных сывороток крови;

       - использование при постановке реакции загрязненных  пробирок,

   пипеток, химических стаканов, мерных цилиндров.

  

         КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

  

       Определение титра  реагинов  и  противотрепонемных  антител  в

   положительных сыворотках крови производится путем  исследования  в

   реакции  связывания  комплемента  уменьшающихся  объемов сыворотки

   крови,  разведенной  изотоническим   раствором   натрия   хлорида.

   Количественный   метод  постановки  реакции  Вассермана  ставят  с

   положительными сыворотками крови, давшими 4+ с кардиолипиновым или

   трепонемным антигенами.

       Сыворотки крови повторно инактивируют 15 минут при 56 град.  С

   в  инактиваторе.  Каждую  сыворотку крови исследуют в 8 пробирках,

   (таблица  N  6).  В первую пробирку наливают 0,8 мл изотонического

   раствора натрия хлорида,  со второй по 7-ю пробирку - по  0,25  мл

   изотонического  раствора натрия хлорида.  В первую пробирку вносят

   0,2 мл испытуемой сыворотки крови,  перемешивают,  затем  0,25  мл

   удаляют,  а  по  0,25  мл  переносят во вторую и восьмую пробирки.

   После перемешивания переносят 0,25 мл из второй пробирки в третью,

   из третьей - в четвертую и т.д.  - до седьмой пробирки, из которой

   0,25 мл разведенной сыворотки крови удаляют.  Затем  приливают  по

   0,25  мл  разведенного кардиолипинового антигена,  разведенного по

   титру,  с  первой  по  седьмую,  а  в   8-ю   пробирку   0,25   мл

   изотонического раствора натрия хлорида. После легкого встряхивания

   по все пробирки приливают по 0,25 мл комплемента,  разведенного по

   рабочей дозе.  Первичная  инкубация  в  термостате при 37 град.  С

   продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5

   мл  гемолитической  системы.  Встряхнув  пробирки,  их  помещают в

   термостат при 37 град.  С  на  45-60  минут  и  после  наступления

   полного  гемолиза  в  восьмой  (контрольной) пробирке регистрируют

   результаты реакции.

  

       Оценка результатов.   Титром  реагинов  исследуемой  сыворотки

   крови является последнее разведение, давшее задержку гемолиза.

       В выдаваемых     лабораторией     анализах     при     наличии

   резкоположительной  реакции  (4+)  указывают,   с   каким   титром

   испытуемой сыворотки получена положительная реакция.

       Количественное определение реагинов имеет значение при  оценке

   эффективности  противосифилитического  лечения.  Быстрое  снижение

   титра реагинов свидетельствует об успешности терапии. Длительно не

   снижающийся  титр  реагинов  указывает на отсутствие эффективности

   терапии и необходимости ее изменения.

  

       Источники ошибок.  Те же,  что  и  при  качественной  методике

   постановки реакции Вассермана.

  

                                                          Таблица N 6

  

         КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

  

   Љ”””””””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї

   ЈИнгредиенты (в мл)     Ј                 NN пробирок                  Ј

   Ј(общий объем - 1,25 мл)“”””””’”””””’””””””’””””’”””””’””””””’””””’””””¤

   Ј                       Ј  1  Ј  2  Ј  3   Ј 4  Ј  5  Ј  6   Ј 7  Ј 8  Ј

   “”””””””””””””””””””””””•”””””‘”””””‘””””””‘””””‘”””””‘””””””‘””””‘””””¤

   ЈИзотонический раствор  Ј 0,8   0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  -  Ј

   Јнатрия хлорида         Ј                                              Ј

   ЈИспытуемая инактивиро- Ј 0,2  -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 0,25Ј

   Јванная сыворотка крови Ј                                              Ј

   “”””””””””””””””””””””””•””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤

   Ј                       ЈПосле перемешивания  из  I  пробирки  0,25  млЈ

   Ј                       Јудаляют,  а во II и VIII пробирки переносят поЈ

   Ј                       Ј0,25 мл.  Из II пробирки  после  перемешиванияЈ

   Ј                       Јпереносят   последовательно   из   пробирки  вЈ

   Ј                       Јпробирку (из II в III,  из III в IV и т.д.  доЈ

   Ј                       ЈVII пробирки включительно) по 0,25 мл.  Из VIIЈ

   Ј                       Јпробирки 0,25 мл удаляют.  Получают разведенияЈ

   Ј                       Јсыворотки крови:                              Ј

   Ј                       Ј 1:5   1:10  1:20  1:40  1:80  1:160 1:320 1:5Ј

   “””””””””””